Western杂交
实验概要
本实验介绍了Western杂交的基本流程。
主要试剂
液氮，提取缓冲液(1 x PBS，10ug/mL Leupeptin，1 mM PMSF，5 mMBenzamidine. 2mM EDTA)，转移缓冲液(39mM Glycine，48mM Tris，0.037% SDS，20%甲醇)，PBST (1 x PBS，0.1% Tween20)，封闭液(1 x PBST，5% skim milk)，杂交缓冲液(1 x PBST，5% skim milk)，一抗，二抗(HRP conjugated)
主要设备
研钵，高速离心机，电泳仪，蛋白电泳槽，PVDF膜，Whatman滤纸，转膜槽
实验材料
植物叶片
实验步骤
1. 蛋白提取
1) 取1-2片植物叶片液氮速冻，研磨成细小粉末。
2) 加入100ul提取缓冲液(1 x PBS，10ug/mL Leupeptin，1 mM PMSF，5 mMBenzamidine. 2mM EDTA)研磨直至均匀。
3) 14000 rpm于4℃离心10分钟，取上清。
2 . Western杂交
1) 配制成10-15%的SDS-PAGE胶，取10-20ug蛋白电泳。
2) 电泳结束后取下蛋白胶，浸泡于转移缓冲液(39mM Glycine，48mM Tris，0.037% SDS，20%甲醇)中。
3) 切一张与蛋白胶相同大小的PVDF膜，在膜左上角标记，用甲醇漂洗后浸泡于转移缓冲液中。
4) 切两张与蛋白胶相同大小的Whatman滤纸，浸泡于转移缓冲液中。
5) 按顺序先后组装转移装置:负极，滤纸，蛋白胶，PVDF膜，滤纸，正极。
6) 100伏电压转移45分钟。
7) 转移完成后取下膜用PBST (1 x PBS，0.1% Tween20)洗5分钟。
8) 将膜置于封闭液(1 x PBST，5% skim milk)中封闭2小时。
9) 用PBST洗膜5分钟。
10) 加入杂交缓冲液(1 x PBST，5% skim milk)，再加入一抗，室温孵育2小时。
11) 用PBST洗膜3次，每次5分钟。
12) 加入杂交缓冲液(1 x PBST，5% skim milk)，再加入二抗(HRP conjugated)室温孵育30分钟。
13) 用PBST洗膜3次，每次5分钟。
14) 用PBS洗膜5分钟。
15) 用ECL显色并照相。
