植物蛋白质组学中的双向电泳技术实验（二）

2. 在平板仪器上进行 IPG-IEF ( Multiphor ll Unit)

满足下列条件时，水化后的 IPG 胶条可以直接放在 IEF 仪器的冷却板上：① 如果运行时间不超过 12 h ( 经常发生在宽的或中等 pH 范 围 IPG，如 IPG 3~10 或 4~7 ) 。② 如果 pH 梯度不超 过 pH 10. 0。③ 如果只用杯上样的方法加很小体积的样品 ( 20 μl ) [ 3，22 ]。使用 Immobiline 干胶条试剂盒中的上样杯更方便进行大体积的样品上样( 直至 100 μl )。当用干胶条试剂盒进行 IEF 时，IPG 胶条可以用硅树脂油或干胶条覆盖油覆盖。当样品为极端碱性（pH > 10.0 ) 蛋白质或用窄 pH 梯度（ pH 范围< 1 单位）进行微量制备电泳时必须用覆盖油等覆盖；而当 pH 范围较宽且 pH 梯度不超过 pH 10.0  ( 如 IPG 4~7 或 3~10 ) 时，使用干胶条试剂盒时可不加覆盖油。

( 1 ) 将冷却盘放入 Multiphor ll 电泳仪中。吸取 3~4 ml 煤油或 IPG 干胶条覆盖油加在冷却盘上，然后将 Immobiline 干胶条盘放在冷却盘上（图 13-2)。在胶条盘和冷却盘之间避免产生气泡。

( 2 ) 将胶条盘上的电极连至 Multiphor  II 电泳仪上。

( 3 ) 将 10 ml 左右的 IPG 干胶条覆盖油或硅树脂油注入胶条盘中，将波纹状的 Immobiline 胶条标尺放在胶条盘中的覆盖油的顶端。

( 4 ) IPG 胶条水化后（见 13. 3.1 节 1.1)，用干净的镊子从水化盘中取出水化好的 IPG 胶条。用去离子水冲洗胶条，然后将胶条放在两层湿润的滤纸之间，用滤纸吸胶条上多余的覆盖油几秒。这样能够防止 IEF 过程中尿素在胶表面结晶。转移水化后的 IPG 胶条（胶面朝上且酸性端对准阳极）放入槽中并靠近标尺。排列 IPG 胶条并保证对着阳极的胶条边缘排列整齐。

( 5 ) 切取两条 IEF 电极条（GE  Healthcare ) 或由厚 2 mm 的滤纸（如 MN440，Macherey  Nagel，Germany ) 制成的滤纸条，其长度为所有 IPG 胶条在胶条盘中排列的相应宽度。用去离子水浸泡电极条，再用滤纸吸走多余液体，然后将湿润的 IEF 电极条放在排列整齐的胶条的阴极和阳极附近。

( 6 ) 将电极放在 IEF 电极条上并轻轻向下按压电极。

( 7 ) 如果样品已经在水化时进入胶条，则用约 80 ml 干胶条覆盖油覆盖胶条，然后转至第 12 步。如果用杯上样方法，则继续第 8 步。

( 8 ) 将上样杯放入上样杯槽中，但要避免接触胶条表面。而且，确保上样杯与阳极 ( 或阴极，如果使用阴极上样）之间有几毫米的距离。

( 9 ) 将上样杯移动至合适位置，每个胶条上一个上样杯，然后轻轻向下压上样杯。上样杯要和胶条紧密接触但不能损坏胶条表面。

( 10 ) 放好上样杯之后，向胶条盘中注入约 80 ml 的干胶条覆盖油以完全覆盖 IPG 胶条。如果覆盖油漏入上样杯，吸出覆盖油，重新调整上样杯，再次检查是否漏液。在每个上样杯中加入几滴干胶条覆盖油。如果使用 pH 为 3~ 10 的宽 pH 梯度进行 IEF，加覆盖油这一步可以省略。

( 11 ) 吸取样品并加人覆盖油下的上样杯底部。再次检查是否漏液。

( 12 ) 关闭等电聚焦箱的盖子，根据表 13-1中的参数开始电泳。为使样品更好地进入胶内，最初几小时的电压应被限制在 150V 、300V、600V。然后用最大电压 3500V 电泳至稳态（见注释 4) 。电流限制在 0.05 mA/IPG 胶条。最佳聚焦温度是 20°C [ 26] 。

( 13 ) 当 IEF 结束后，从胶条盘中取出电极、上样杯槽和 IEF 电极条。用干净的镊子从胶条盘中取出 IPG 胶条。如果 IPG 胶条不被立刻用来进行第二向电泳和（或）用来进一步研究，可将它们夹在两层塑料膜之间贮存在 -70°C，可贮存数月。

3. 使用 IPGphor 电泳仪进行 IPG-IEF

使用一种叫做 IPGphor ( GE Healthcare，最近 Bio-Rad 也开发出一套类似的系统）的整体系统可使双向电泳中的 IPG-IEF 简化 IPGphor 包括一个可精确控温（在 19.5~20.5°C ) 的 Peltier 元件和一个可编程的电源。这个仪器的核心部分是不同长度的（7cm、11cm、13cm、18cm 或 24cm) 氧化铝陶瓷制的细槽，被称为持胶槽。IPG 胶条可在持胶槽中水化并同时上样，然后进行 IEF。当胶条被放入持胶槽后，后续步骤无需对胶条进行进一步操作（图 13-2)。IPGphor 是可编程的，而且最多可以存储 10 组不同程序。该仪器支持延迟启动，这使得使用者可以在下午在持胶槽中用含有样品的水化液水化胶条，然后晚上 IEF 自动启动并在第二天早上结束。

当在碱性 pH 范 围内（＞ pH 10.0 ) 进行蛋白质分离时，用杯上样的方法单独对不同的水化好的 IPG 胶条上样比用水化上样的方法上样得到的分离效果好得多。可以使用特殊杯上样（“ 通用” ）IPGphor 持胶槽，或复合式杯上样持胶槽（“ 复合式” ）进行样品的杯上样（图 13-2)。杯上样最多允许上 100 μl 样品（见注释 3) 。持胶槽平台能够调节温度并能将持胶槽与电源连接。除了操作简单外，IPGphor 的另一个优势是聚焦时间短。这是因为用 IPGphor 能在很髙的电压下（最高 8000 V ) 进行 IEF。

使用 IPGphor 进行 IEF 的典型工作条件见表13-2和 表 13-3 。正如前文指出的那样 ，为了使高分子质量的蛋白质更好地进入聚丙烯酰胺胶内，水化时应在胶条两端加低电压（30~50 V ) ，否则将给水化上样造成困难[ 15，28] 。然后电压逐步升高至 8000 V。如果 IPG 胶条的分离长度 < 11 cm，电压应限制在 5000 V 内。为在分离含盐量高的样品或使用窄 pH 间隔分离样品时得到最佳效果，在电压升髙至 8000 V 之前可在电极和 IPG 胶条之间垫上湿润的滤纸片（尺寸：4mm X 4mm