IVIg冻融制剂的加速应力试验
用含1mg /mL IVIg的4ml配方填充硼硅酸盐瓶(6ml)和SiOPlas™瓶(6ml)， PBS pH 7.4。小瓶的内容物经过1或6次冻融循环。在每个冻融循环中，小瓶先在液氮中浸泡2 min，然后在30_C水浴中解冻14.5 min，轻轻旋转搅拌后再进行下一个冻融循环。

亚可见粒子浓度分析
如前所述，使用流式成像颗粒分析仪(FlowCAM®，Fluid imaging Technologies, Scarborough, ME)获取不同强调配方中的颗粒浓度和颗粒图像。经过6次冻融循环的样品中颗粒浓度接近或超过流动成像显微镜仪器的上限，因此在分析前用pH 7.4的PBS稀释100倍。在强调的配方中，颗粒计数被测量在相同的单个注射器和小瓶被测试补体激活的样本中。每个样品都有一个颗粒大小分布；在测试强化配方激活补体的能力之前，尽量不让颗粒分形。
 

表1 进行补体激活试验的受应力样品中亚可见颗粒的浓度

从每个应力/容器组合中收集3个样品。容器与容器之间的颗粒浓度差别<15%。
 
可溶性蛋白组分的排阻色谱分析
排阻色谱被用来监测单体蛋白的保留和在应用搅拌或冻融应力后IVIg样品中任何可溶性聚集物的外观。TSKgel G3000SWXL柱(TOSOH Biosciences, montgomery yville PA)与Agilent 1100系列柱(Santa Clara, CA)一起使用。洗脱液在安捷伦化学站软件中以280 nm的吸光度进行监测。流动相为100mm硫酸钠、100mm磷酸钠和pH为6.7的0.05% (w/v)叠氮化钠，以0.6 mL/ min的速度通过系统。色谱图中的峰面积用GRAMS/AI version 9.1 (Thermo Fisher Scientific Inc.， Waltham, MA)进行量化。在应用加速应力条件后，从(本质上)无颗粒、离心和过滤的起始配方的可溶性蛋白的部分损失被量化使用峰面积的比率为应力和非应力配方。

人类血清样本中的补体激活
从3个小瓶或注射器中收集的不同应激IVIg制剂的样品以及每种制剂的非应激对照样品被送往Exsera BioLabs (Denver, CO)，以分析它们激活补体的能力。补体激活在3个个体献血者的正常血清池中进行了测量，这些献血者之前曾筛查过补体功能正常。将胁迫的IVIg制剂的试验样品稀释10倍到混合的人血清中，混合后在37°C孵育30分钟。孵育后，样品在80°C保存，直到进行进一步的测试。为了分析补体的活化，使用从Quidel公司(San Diego, CA)购买的试剂盒，采用ELISA法测定了四种补体级联活化片段C3a、Bb、C4a和C5a的浓度。选择C4a是因为它是经典或凝集素通路激活的标志，Bb是补体激活备选通路的明显标志，C3a是补体激活的中心点，C5a是补体通路终端激活的标志。对四种补体级联蛋白分别进行了40次3遍重复ELISA检测。除了测试应激IVIg样本，还分析了几个对照。这些对照样品仅包含混合血清或血清样品，其中以1:9的比例加入含zymosan的生理盐水PBS或含热聚集伽马球蛋白的PBS。测量的平均值与颗粒样本计数相比，在盐水对照中测量的浓度增加了一倍。

结果

IVIg配方的加速应力测试中颗粒的形成
正如预期的那样，每种加速应力测试方法都会在测试配方中产生微颗粒(表1)。在pH 7.4的PBS条件下，IVIg的冻融产生的亚可见颗粒最多。在硼硅酸盐和SiOPlas™瓶中，一次冻融循环分别产生3.2◊10⁵和7.1◊10⁵个粒径大于2微米的颗粒。也生产了大于10微米的颗粒，在硼硅酸盐瓶中检测到8.0◊10⁴个颗粒，在SiOPlas™瓶中检测到5.1◊10⁴个颗粒。

多次冻融循环使颗粒数进一步增加了约一个数量级(表1)。6次循环后，硼硅酸盐瓶和SiOPlas™瓶中的颗粒浓度分别增加到：大于2微米的4.8◊10⁶和2.1◊10⁶个颗粒/mL。也生成了大于10微米的颗粒，分别在硼硅酸盐瓶和SiOPlas™瓶中生成2.3◊10⁵和3.6 ◊10⁵个颗粒。

由于搅拌应力而产生的颗粒数量取决于容器类型和所应用的搅拌类型。使用定轨摇床pH值7.4 PBS中的IVIg配方进行昼夜不间断搅拌，在硅化玻璃注射器中产生了大于2微米的颗粒浓度6.0◊10⁵个/毫升，以及在SiOPlas™注射器中产生了2.4◊10⁶个颗粒 /毫升，如 (表1)。与冻融研究一样，两种类型的注射器形成大颗粒(> 10微米) 的差别约一个数量级。

在“端到端”旋转10天的加速稳定性试验中。pH为4.25甘氨酸IVIg制剂在硅化玻璃注射器和SiOPlas™注射器中分别检测到粒径大于2微米的1.0◊10⁵和3◊10³颗粒/mL。相应的，大于10微米的颗粒也较少，在硅化玻璃和SiOPlas™注射器中分别检测到2.0◊ 10³和90个颗粒/mL。

图1展示了由各种加速应力方法产生的典型的由流式颗粒成像分析仪（FlowCam）所捕捉到的颗粒图像。在小瓶中，冻融应力下的样品主要含有具有蛋白质聚集物特征的非球形微粒，硅化玻璃注射器中搅拌应力下的样品包含大量球形颗粒，这是滴润滑剂颗粒的特点(图1 a、c、e和f)。在SiOPlas™注射器中，搅拌应力作用下产生颗粒具备形状不规则蛋白质聚体和球形硅油液滴(图1 b和d)。

对于所有的加速应力条件测试，尺寸排除色谱分析显示，只有<5%的不溶性蛋白形成。在任何条件下均未检测到可溶性聚集物。在硼硅玻璃小瓶中，6次冻融循环使IVIg产生的颗粒浓度最高，达到大于2微米颗粒500万个/毫升，但这仅表示损失了3.7%的原始单体蛋白。

在加速应激条件下产生的颗粒对人血清中的补体激活
当IVIg配方被稀释10倍于人血清时，在加速应激条件下，IVIg配方中大于2微米的颗粒与激活补体呈线性关系(图2-4)。在大于10微米颗粒数量较多的样本中，补体激活水平通常较高，但这些较大颗粒的水平较低，不能明确的剂量的相关性见图5。

观察到的补体激活与通过替代途径的激活一致。没有增加C4a盐水控制水平,这是一个典型的标志或凝集素途径(图6)。相比之下,Bb,补体激活的标记的替代途径,增加线性(r²=0.94)的浓度大于2微米粒子尺寸范围的增加(图2)。

增加过敏毒素的浓度C3a Ca5也观察到当粒子被稀释到血清(图3和4)。与Bb响应,褶皱增加与盐水控制线性依赖于粒子的剂量,与相关系数r2 C3a和ca5的0.85和0.99,分别。对IVIg配方的反应，在硼硅酸盐玻璃小瓶中经过6次冻融循环后，C3a和C5a的浓度增加了2.4- 8.9倍，比在生理盐水对照组中观察到的要高。