关于变性梯度凝胶电泳的介绍

　　变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE) 利用由碱基序列所决定的DNA片段溶解度或变性度的差异，达到分离野生型与突变型DNA片段的目的，该手段分辨率达一个碱基。当DNA 双链沿变性剂浓度梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶迁移时，DNA分子中解链温度（Tm) 低的部分逐渐变性解链。一般总是错配碱基部分的异源双链Tm最低，最容易解链，其次是富含AT 碱基对的部位，富含GC碱基对的部位Tm值较高所以解链较难。因此，正常DNA双链和异源双链在梯度变性胶中电泳时，异源双链总是先解链。将PCR 产生的双链DNA在浓度递增的尿素和甲酰胺变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，当某一DNA片段迁移到变性剂浓度与其最低Tm相当的位置时，该片段低温解链部分的双链打开，部分解链导致DNA迁移速度明显下降，观察样品的迁移率变化即可判断是否存在变异。DGGE 敏感性高，即便异源双链中仅含一个错配碱基，在电泳时也可分辨其迁移率的改变。DGGE 方法的单碱基突变检出率在DNA片段长度600 bp 以内可以达到95%。

　　DGGE 的成功有赖于双链DNA内部低温解链部分变性后迁移率的改变。但在相当于最高Tm的变性剂浓度的位置，相应的DNA片段可能全部解链，使试验无法检出存在于高Tm DNA片段中的碱基替换。为了解决此问题，可以在一个PCR 引物的5 ' 端设计一段富含GC的尾巴，从而使PCR 扩增产物的一端富含GC 碱基对，保证了绝大多数DNA片段不会发生完全解链，在最高变性剂浓度区域仍然可以分辨出部分解链的异源双链，这一改进使DGGE 的突变检出率接近100%，但DGGE 只能检测突变是否存在而不能确定突变的位置。

　　DGGE 方法需要设计特定片段最佳的PCR引物以及最佳变性条件，这一过程比较复杂，梯度变性胶的制备需要的设备较昂贵，所以在常规实验室不易实施。