用这一方法制备的 DNA 适用于琼脂糖凝胶电泳、Southern 印迹、亚克隆、基因组文库构建、PCR 或其他不需要完整的高分子质量 DNA 的方法。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。
| 实验方法原理 | 用这一方法制备的 DNA 适用于琼脂糖凝胶电泳、Southern 印迹、亚克隆、基因组文库构建、PCR 或其他不需要完整的高分子质量 DNA 的方法。 |
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| 实验材料 | YAC 克隆的酵母菌落 |
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| 试剂、试剂盒 | 醋酸铵乙醇酚氯仿TETriton SDS 溶液 |
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| 仪器、耗材 | YPD 培养基Sorvall SS-34 转头或同类产品玻璃珠 |
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| 实验步骤 | 一、材料
1. 缓冲液和溶液
醋酸铵（10 mol/L )
乙醇
酚：氯仿（1:1，V/V)
TE ( pH 8.0)
含 20 μg/ml RNase 的 TE ( pH 8.0)
Triton/SDS 溶液
2. 培养基
YPD 培养基
3. 离心机和转头
Sorvall SS-34 转头或同类产品
4. 专用设备
玻璃珠
5. 载体和酵母菌株
携带目的 YAC 克隆的酵母菌落
二、方法
细胞培养
1. 将一个含目的 YAC 克隆的酵母菌落接种到 10 ml YPD 培养基中，30℃ 振摇过夜。
2. 2000 g ( Sorvall SS-34 转头，4100 r/min) 离心 5 min 收集细胞。
3. 弃去培养基，加 1 ml 无菌水，轻轻振动，使细胞悬浮于溶液中。
4. 按步骤 2 的方法收集细胞。
5. 去除上清，将细胞重悬于 0.5 ml 无菌水，然后移入一 1.5 ml 无菌离心管中。
6. 室温下在微量离心机中以最大转速离心 5 s，去除上清，收集细胞。
DNA 的提取
7. 加入 0.2 ml Triton/SDS 溶液于细胞中，轻叩离心管侧壁，使细胞沉淀重新悬浮。
8. 加入 0.2 ml 酚: 氯仿和 0.3 g 玻璃珠。室温振荡 2 min。加 0.2 ml TE ( pH 8.0)，稍加振荡，使体系混匀。
9. 室温下，在微量离心机中以最大转速离心 5 min，使有机相和水相分开。将上层水相移入另一新的离心管中。小心操作，避免将两相界面处的物质吸入。
DNA 的分离
10. 加入 1 ml 乙醇到水相中，盖上管盖，将小管轻轻翻转数次，混匀。
11. 在微量离心机中以最大转速 4℃ 离心 2~5 min, 使 DNA 形成沉淀。用巴斯德吸管吸去上清。再次进行短暂的离心（2 s ), 除去离心管底部最后残余的乙醇。
12. 用 0.4 ml 含 RNase 的 TE ( pH 8.0 ) 溶解核酸沉淀，然后在 37℃ 温育 5 min。
13. 加入等体积酚: 氯仿溶液抽提经 RNA 酶消化后的溶液。最好用翻转离心管的方法混匀，不要用涡旋振荡。室温下，在微量离心机中以最大转速离心 5 min, 使水相和有机相分层。将水相移入另一新离心管中。
14. 在水相中加入 80 μl 10 mol/L 醋酸铵和 1 ml 乙醇。轻轻地翻转小管进行混匀。室温放置 5 min。
15. 微量离心机离心 5 min 收集 DNA 沉淀。弃上淸，用 0.5 ml 70% 乙醇灌洗核酸沉淀。 以最大转速离心 2 min, 用巴斯德吸管吸去乙醇漂洗液。再次进行短暂的离心（2 s), 吸去离心管底部最后残余的乙醇。将 DNA 沉淀在空气中干燥 5 min，然后用 50 μl TE (pH 8.0) 溶解。 |
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