时间分辨荧光免疫分析（time resolved luoro-immunoassay，TrFIA）技术出现于20世纪80年代初期，是在免疫荧光分析的基础上发展的一种新型超微量物质免疫分析方法。 TrFIA采用镧系稀土元素标记抗体，利用荧光发射体的荧光寿命差别将波长相同的荧光分开，排除样品中的非特异荧光的干扰，从而最大限度地提高分析方法的灵敏度。该方法在灵敏度、特异性、稳定性及测量自动化等方面可与放射免疫分析（RIA）相媲美，最小检出值可达10^-8mol/L，且无放射性污染。

【基本原理】

    镧系稀土元素铕（Eu³⁺）、钐（Sm³⁺）等通过具有双功能集团的螯合剂，容易与抗体分子以共轭双键结合制成标记物。当标记抗体和抗原结合后，稀土元素螯合物在紫外光（340nm）激发下，不仅发射出高强度的荧光（613nm），而且衰变时间较长（10ms-1ms），而待测样品中各种蛋白荧光和其他化合物的非特异荧光的衰变时间一般在1ns-10ns，最长不超过20ns。利用延缓测量时间，待样品中的非特异的、短命荧光全部衰变后，再测量稀土元素螯合物的特异荧光，就可以完全排除非特异本地荧光的干扰。

【试剂及材料】

（1）分析缓冲液：0.1mol/L，pH7.5 Tris-HCl缓冲液，其中含0.3mol/L三氯醋酸钠，0.1%BSA，0.02%NaN₃；

（2）洗涤液：生理盐水，含0.1%Tween-20；

（3）荧光增强液：b-萘酰三氟丙酮6mg，三辛基磷化氢的氧化物19.33g，邻苯二甲酸氢甲1.3g，冰醋酸6ml，Tween-20 0.2ml， 加三蒸水至500ml， 再加Triton-100 1ml，置37℃水浴至溶解后，补加三蒸水至1000ml，于塑料瓶内保存备用。

（4）T₃和T₄的标准物；

（5）LKB ARCUS-1230时间分辨荧光仪（Pharmacia）；

（6）Eu³⁺标记的Tg（Eu-Tg）：标记方法见附注；

（7）0.1mol/L，pH9.6碳酸盐缓冲液

【操作方法】

（1）用0.1mol/L，pH9.6碳酸盐缓冲液将T₃和T₄抗体稀释到10mg/ml，加入12孔聚苯乙烯滴定条孔中，每孔100ml，室温放置20h；

（2）甩弃包被液，用洗涤液洗3次；

（3）分别加入不同稀释度的T₃和T₄的标准物及待检血清，每孔20ml；

（4）迅速加入100ml 用分析液稀释的Eu-Tg，微量板震荡器上混匀；

（5）室温2h，洗涤液洗涤10次；

（6）每孔加入100ml荧光增强液，慢慢振动5min后，室温静止30min；

（7）用LKB ARCUS-1230时间分辨荧光仪测定荧光强度。

【结果分析】

    以不同稀释度的T₃和T₄的标准物为横坐标，以相应的荧光强度为纵坐标绘制标准曲线，从标准曲线上就可确定地得知样品中待测样品中T₃和T₄的相应含量。

【附注】Tg 的Eu³⁺标记技术

①将1mgTg和1mgcDTPA溶于0.5mol/L，pH8.2碳酸盐缓冲液中，室温反应10min；

②用1mol/L NaHCO₃调至pH9.0；

③用饱和硫酸铵沉淀；

④沉淀用0.5ml 1.2mmol/L EuCl3溶液(0.1mol/L，pH6.0柠檬酸缓冲液配制)反应40min；

⑤用Sephadex G-50柱层析分离，即得Eu-Tg。