桔梗提取物中桔梗皂苷D的反相高效液相色谱检测方法
【摘要】 目的建立桔梗提取物中桔梗皂苷D的高效液相色谱（HPLC）检测方法。方法采用RP－HPLC法、蒸发光散射检测器（ELSD）测定桔梗皂苷D含量。色谱柱为Agilent ODS（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈∶0.5％乙酸溶液＝28∶72，流速1.0 ml/min；检测器为Waters ELSD 2420。结果桔梗皂苷D在0.015 625～0.25 mg/ml范围内与峰面积具有良好的线性关系，r=0.999 6。桔梗皂苷D平均回收率为98.25％，RSD为1.18％。结论通过6批不同的桔梗提取物的含量测定，证明该方法简便、准确、可靠。
【关键词】 桔梗提取物； 桔梗皂苷D； 反相高效液相色谱法； 蒸发光散射检测
Abstract：ObjectiveTo establish an RP-HPLC determination method of the platycodin D in Platycodon Grandiflorum extracts. MethodsPlatycodin D content was detected by high performance liquid chromatogram-ELS Detector（HPLC－ELSD）. Agilent Hypersil ODS (4.6 mm×250 mm，5 μm) was used , mobile phase was V (acetonitrile)∶V (0.5％acetic acid)=28∶72 at 1.0 ml/ min speed. ELSD2420 detector was used for qualitative and quantitative analysis in external standard method.ResultsPlatycodin D has good linear relation in 0.015625 mg/ml－0.25 mg/ml. r=0.9996. The recovery of platycodin D was 98.25%, RSD was 1.18%. ConclusionThe content of platycodin D in six different groups of samples is determined. The obtained results indicate that this method is simple, accurate, and credible.
Key words：Platycodon grandiflorum extracts； Platycodin D； HPLC-ELSD； Analytic method
在我国，以中药材为原料的中药提取物被用于医疗或保健食品已形成了一定的生产规模。规范中药提取物的质量对中药产业的发展至关重要，大量中药提取物还有待制订国家标准或行业标准［1］。
桔梗提取物具有多种生物活性和很好的药用价值［2］，是市场畅销的中药提取物之一，但现无严格的质量标准。桔梗总皂苷是桔梗提取物的主要药效成分，其中桔梗皂苷D含量最高，药效较确定［3］。
2005年版《中国药典》中桔梗药材是以总皂苷为指标，采用重量法测定总皂苷含量［4］，精确性较低。许传莲等［5～7］用高效液相色谱紫外检测器检测桔梗药材中桔梗皂苷D，但桔梗皂苷D 无共轭结构,无强的发色基团,末端吸收检测干扰较大。
目前尚没有报道检测桔梗提取物中桔梗皂苷D的相关文献。本文以桔梗皂苷D为指标，采用HPLC-ELSD为检测方法，对桔梗提取物中的桔梗皂苷D进行了分析研究。
1 仪器与试药
1.1 仪器：Waters高效液相色谱仪［Waters515高压泵，Waters2420蒸发光散射检测器（ELSD），Empower数据处理系统］，SIGMA 3K15型离心机，Mettler Toledo AG135型电子天平，SC5202型超声波清洗器。
1.2 试药桔梗药材由亳州济人药业有限公司提供。桔梗提取物由本中心按拟议中的标准生产工艺制备。桔梗皂苷D对照品购于吉林农业大学药学院。乙腈为色谱级，水为重蒸水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件色谱柱为Agilent Hypersil ODS柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈∶0.5％乙酸＝28∶72，柱温为25℃，流速1.0 ml/min。ELSD参数：雾化器温度36℃，漂移管温度75℃，载气压力25psi。理论塔板数按桔梗皂苷D峰计算应不低于3000，桔梗皂苷D的峰与其他峰能达到基线分离，且出峰时间适宜，峰形较好。
2.2 对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的桔梗皂苷D对照品2.5 mg，置10 ml容量瓶中，加乙腈∶0.5％乙酸(28∶72)溶液至刻度，摇匀，即得0.25 mg/ml的对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备取桔梗提取物干粉50 mg，精密称定，置100 ml具塞锥形瓶中，加甲醇约50 ml，超声处理（功率250W，频率40kHz）30 min，过滤，滤液蒸干，用适量水溶解，然后用乙醚萃取1次，弃去醚层，水层用水饱和正丁醇萃取3次，合并醇液，蒸干，用5ml甲醇复溶，溶液离心处理（10 000 r/min，10 min），微孔滤膜过滤，取滤液，即得。
2.4 线性关系的考察精密吸取对照品溶液逐级稀释成0.25，0.125，0.0625，0.03125，0.015625 mg/ml 5个不同浓度的对照品溶液，按上述条件进样，进样量10 μl/次，测定其峰面积，然后以桔梗皂苷D浓度的自然对数为横坐标，峰面积的自然对数为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程为Y＝1.233X+13.443，r=0.999 6；实验结果表明桔梗皂苷D的浓度在0.015 625～0.25mg/mL范围内与所测得的相应峰面积呈良好的线性关系。
2.5 精密度实验精密吸取0.0625mg/ml的对照品溶液10μl进样，重复进样6次，按上述色谱条件测定桔梗皂苷D的峰面积分别为22 561，22 108，22 235，22 463，22 412，22 369。RSD＝0.73％。结果表明本方法的精密度良好。
2.6 稳定性实验精密吸取供试品溶液，按上述色谱条件，每隔2 h进样1次，共进样6次，桔梗皂苷D的峰面积分别为30 938，32 535，31 427，31 656，32 009，30 786。RSD＝1.58％。结果表明，桔梗皂苷D的峰面积在10 h内无明显变化，供试品溶液稳定性好。
2.7 重复性实验取同一批样品，用“2.3”项的方法处理，平行试验6次，测得桔梗皂苷D的含量为0.086 6，0.086 2，0.087 5，0.085 1，0.083 9，0.087 7 mg/ml。RSD＝1.72％。结果表明，在同一条件下，6次测得样品桔梗皂苷D含量一致，本方法重复性好。
2.8 回收率试验采用加样回收法，精密称取已知含量的样品6份，每份0.5g，精密添加桔梗皂苷D对照品3 mg，按“2.3”项下的方法制成样品溶液，取10 μl进样，测定桔梗皂苷D的含量。计算平均回收率为98.25％，RSD＝1.18％。结果见表1。结果表明，本方法回收率好。
表1 加样回收率试验结果（略）
2.9 样品含量测定按“2.3”项的方法制备样品，用上述方法对以下不同批次的桔梗提取物进行含量测定。结果见表2。
表2 桔梗提取物中桔梗皂苷D含量测定结果（略）
3 讨论
通过改变ELSD的参数及流动相的组成与配比，最终选定漂移管温度：75℃；载气压力25psi。雾化器温度：36℃；流动相用乙腈∶0.5％乙酸＝28∶72。较文献［8］用乙腈∶水＝28∶72增大了桔梗皂苷D峰的响应值，提高了桔梗皂苷D的检测限。同一样品使用两种不同流动相时色谱图比较，见图1和图2。
桔梗多糖在提取及分离过程中部分被去除，含量降低，但是仍然影响测定结果，因此在前处理过程中用水饱和正丁醇萃取除糖，排除了桔梗多糖峰的影响。
由于桔梗皂苷D只有一个C=C双键，紫外吸收弱，且末端吸收在203nm有较大的干扰。选用HPLC-ELSD，可以避免以上问题，提高检测的精密度，见图3和图4。
本实验结果为桔梗提取物质量标准的制定提供了可供参考的分析方法。
【参考文献】
［1］ 徐为公，徐 鹏.中药提取物的国际化策略［J］. 中药研究与信息，2005，7（10）：34.
［2］ 付文卫，窦德强，裴月湖.桔梗的化学成分和生物活性研究进展［J］. 沈阳药科大学学报，2006，23（3）：184.
［3］ 肖崇厚.中药化学［M］.上海：上海科学技术出版社，1997：419.
［4］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］，2005：196.
［5］ 许传莲，郑毅男，杨腊虎，等. HPLC法测定不同采收期及不同部位桔梗中桔梗皂苷D含量［J］.吉林农业大学学报，2001，23（1）：58，64.
［6］ 郭 丽，肖永庆，张 村，等. 桔梗药材中桔梗皂苷D的定性定量方法研究［J］.北京中医药大学学报，2007，30（3）：200.，209.
［7］ 石俊英，王 颖，巩丽丽，等. HPLC法测定桔梗不同部位、不同产地药材中桔梗皂苷D含量［J］.山东中医药大学学报，2007，31（6）：501.
［8］ 朱丹妮，舒 娈，郅 慧，等.HPLC－ELSD 法测定桔梗中桔梗皂苷D的含量［J］.植物资源与环境学报，2001，10（4）：11.
