利用沃特世Prep 150 LC系统分离银杏叶中的黄酮类化合物

简介

银杏叶入药治疗多种疾病的历史可追溯千年之久¹。银杏叶提取物中含有多种活性化合物，尤其富含黄酮类化合物，主要为槲皮素、山柰酚和异鼠李素(图1)。

通常来说，天然产物的纯化目的是将可能具有生物活性的单一化合物成分分离出来。分离出的这些化合物累积到足够量后即可应用于多种用途，例如标准品的制备，或供其它研究使用(如，临床试验，生物检测等)。所有分离出的化合物都需要达到尽可能高的纯度，并且制备过程需要尽可能的快速有效。过去的文献中介绍过诸多有关天然产物提取、分离和纯化的技术²，制备级反相高效液相色谱仪(RP-HPLC)在此类操作中的应用广泛，被视为是一种适用于多类化合物的快速、可靠与稳定的技术。本应用纪要将介绍利用沃特世(Waters^®)Prep 150 LC系统(图2)分离银杏叶粉末中的黄酮类化合物。

实验方案及色谱条件

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提取

将银杏叶粉末(20 g)加入100 mL甲醇中，超声60 min。加入40 mL 3N的盐酸后，将此混合物加热至沸腾并回流90 min。此回流操作可将黄酮苷水解成单个的黄酮化合物。冷却至室温后，使用Whatman #1滤纸对提取物进行过滤即可，无需进一步处理。

结果与讨论

对制备所得的提取物进行梯度UPLC^®分析，结果显示其中槲皮素和山柰酚的浓度分别为0.088和0.104 mg/mL(未获得异鼠李素的定量标准品)，根据UV (371 nm)条件下测得的峰面积百分比计算所得三种化合物的总体纯度约为11%，14%和5%(图3)。借助于先前开发出的分析级等度HPLC方法(图4)，使用内置于ChromScope软件中的Analytical to Prep Gradient Calculator(分析级至制备级梯度计算器，图5)可计算出几何放大至内径为19 mm的色谱柱时所需的制备级分离流速。分析级至制备级梯度计算器是一款简便且易用的工具，可进行分析级至制备级操作的几何缩放计算，提供流速与梯度时间计算信息。分析级方法到制备级方法的准确放大可实现在分析级规模下进行方法开发，从而能够节省样品并减少方法开发所需的溶剂使用量。放大的制备级色谱会与分析级色谱十分相似，使用户能够准确地通过放大的制备级方法收集目标峰。之前发布的应用纪要3中对此类放大计算提供有更详细的描述。

实验通过等度纯化分离方法和基于阈值的馏分收集方法，使用0.25 mL的进样量实现了结果可接受的制备级分离(图6)。通过ChromScope软件可设置在收集时间段中通过阈值收集轻松实现各馏分的收集(图7)。本示例中定义了一对收集时间段(3.0至4.0 min和6.0至7.5 min)，定义时间段以外洗脱出的所有峰都不会收集到最终的组分中。每个定义时间段中的洗脱峰必须满足峰阈值条件(本示例中第一个时间段的阈值为25 mAU，第二个时间段阈值为15 mAU)
才能实现正确的收集操作。根据UPLC分析(数据未示出)，所收集馏分的纯度分析显示三种化合物的紫外吸收峰面积%纯度分别为87%、96%和85%。

结论

■ 本实验采用沃特世Prep 150 LC制备级HPLC系统对银杏叶粉末提取物中的物质进行了分离与纯化。
■ 沃特世ChromScope软件(1.4版)的全面化系统控制提供了出色的系统灵活性，用户可对所有的方法参数进行轻轻修改。
■ 实验先开发出了分析级分离方法，然后利用分析级至制备级梯度计算器将此方法几何放大至Prep 150 LC系统上的19×100 mm制备级色谱柱。
■ 简单易设置的馏分收集实现了目标化合物的精确收集。
■ 初始提取物中包含15%的槲皮素和18%的山柰酚，通过这套易于使用的Prep 150 LC系统可将每种组分的纯度提高到87%以上。

参考文献

1. PDR for Herbal Medicines, 4th Ed., 2007, Thompson Healthcare Inc,Montvale NJ, U.S.A.
2. Natural Products Isolation 2nd edition, edited by S.D. Sarker, Z. Latif, A.I.,2006 Humana Press Inc, Totowa, NJ, U.S.A.
3. “Analytical HPLC to Preparative HPLC: Scale Up Techniques usinga Natural Product Extract.” Andrew Aubin and Ronan Cleary.Waters Application Note 720003120en, 2009