植物蛋白质组学中的双向电泳技术实验（三）

使用 IPGphor 进行 IEF 的典型工作条件见表13-2和 表 13-3 。正如前文指出的那样 ，为了使高分子质量的蛋白质更好地进入聚丙烯酰胺胶内，水化时应在胶条两端加低电压（30~50 V ) ，否则将给水化上样造成困难[ 15，28] 。然后电压逐步升高至 8000 V。如果 IPG 胶条的分离长度 < 11 cm，电压应限制在 5000 V 内。为在分离含盐量高的样品或使用窄 pH 间隔分离样品时得到最佳效果，在电压升髙至 8000 V 之前可在电极和 IPG 胶条之间垫上湿润的滤纸片（尺寸：4mm X 4mm) ( 见注释 4 ) 。当 IEF 结束后，按13. 3.1 节 2. 第 13 步中的方法贮存 IPG 胶条。

1 ) 水化上样 IEF

( 1 ) 将所需数量的持胶槽放在冷却盘或 IPGphor 的电极区（图 13-2 ) 上。吸取适量 （如 180 mm 长 IPG 胶条吸取 350 μl）的含有样品的 IPG 干胶条水化液注入持胶槽中，将 IPG 胶条胶面朝下放入水化液中，然后用 IPG 干胶条覆盖油覆盖。具体方法见 13. 3.1 节 1. 2) 。

( 2 ) 设置 IPGphor  ( 所需的水化时间、伏小时、电压梯度）。

( 3 ) IPG 胶条水化后（至少需要 6 h，通常过夜），按表 13-2 所列参数开始 IEF。

( 4 ) IEF 完成后，将那些不立刻进行第二向电泳的 IPG 胶条夹在两层塑料膜之间贮存于 -70°C。

2 ) 杯上样 IEF

( 1 ) 在水化盘中用不含样品的水化液水化 IPG 干胶条。IPG 胶条水化后，用干净的镊子将水化好的 IPG 胶条从水化盘或水化盒中取出。用去离子水冲洗胶条，然后将胶条放在两层湿润的滤纸之间，用滤纸吸胶条上多余的覆盖油几秒。这样能够防止 IEF 过程中尿素在胶表面结晶。见 13. 3.1 节 2. 。

( 2 ) 将所需数量的杯上样持胶槽放在冷却盘或 IPGphor 的电极区上，确保持胶槽的尖端（阳极）与电极区的阳极区相连。可以使用复合式持胶槽代替独立持胶槽。

( 3 ) 将水化好的 IPG 胶条放入杯上样持胶槽（或复合式持胶槽）中，胶面朝上且胶条尖端（酸性端）对准阳极。确保 IPG 胶条的阴极距离槽的末端约 1.5 cm 且通过电极丝与电极连通。

( 4 ) 用去离子水润湿两张电极滤纸垫片（尺寸：4 mmX10 mm) ，用滤纸吸掉过多的去离子水，然后将润湿的电极滤纸垫片放在阳极和阴极电极与 IPG 胶条之间 IPG 胶条的表面上。如果必要（如当样品含盐量高），数小时后可以更换新的滤纸垫片。

( 5 ) 将活动电极放在电极滤纸垫片上。夹紧电极使其紧压电极滤纸垫片。

( 6 ) 将可移动的上样杯放在阳极或阴极附近，然后轻轻将上样杯压在 IPG 胶条表面上。上样杯应与 IPG 胶条紧密接触但不能损伤胶条表面。

( 7 ) 为确保上样杯不漏液，向杯中加入 100 μl IPG 覆盖油。如发现漏液，除去覆盖油并用绵纸吸净覆盖油，然后重新放置上样杯。再次检查是否漏液。上样前吸出覆盖油。

( 8 ) 每根胶条用 2~4 ml IPG 胶条覆盖油覆盖（建议不要使用硅树脂油或煤油替代 IPG 胶条覆盖油）。万一覆盖油漏入上样杯，重新放置上样杯并用绵纸吸净杯中的覆盖油。再次检查是否漏液，然后吸取样品（20~100 μl ) 加入上样杯。

( 9 ) 设置仪器（所需伏小时、电压梯度、温度等）并按表 13-2 和表 13-3 中推荐的参数进行 IEF。省去表 13-2中为水化上样推荐的低电压水化步骤。

( 10 ) IEF 完成后，继续进行平衡或第二向 IEF ( SDS-PAGE ) ( 见 13.3.3 节），或将 IPG 胶条夹在两层塑料膜之间贮存于 -70°C，可贮存数月。

3.2 IPG 胶条平衡

在进行第二向分离（SDS-PAGE ) 之前，平衡 IPG 胶条使胶条中分离的蛋白质与 SDS 充分作用十分重要。由于与载体两性电解质凝胶相比，聚焦后的蛋白质与 IPG 胶条的结合更加紧密，因此需要相对长的平衡时间（10~15 min) 以及尿素和甘油来改善蛋白质在第一向和第二向之间的转移效果。其中尿素和甘油可以减轻电渗作用的影响。目前最常用的步骤是将 IPG 胶条在一种最初由 Gorg 等 [13] 提出的缓冲液 [ 50 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.8) 、2%  (m/V ) SDS、1% ( m/V）DTT、6 mol/L 尿素、30%  (m/V) 甘油；表 13-4 中平衡 10~15 min。然后再将胶条在把上述缓冲液中的 DTT 换成 4% ( m/V ) 碘乙酰胺后形成的缓冲液中进一步平衡 10~15 min。后面的步骤是用来烷基化游离的 DTT，否则 DTT 会在第二向 SDS-PAGE 胶中迁移，从而导致点拖尾现象。该现象在银染之后就会被观察到。更重要的是，碘乙酰胺会烷基化巯基并阻止它们的氧化还原作用。我们强烈推荐使用这种还原/烷基化两步程序，这是因为它能够相当程度上简化后续质谱鉴定的样品制备工作（胶内消化蛋白质）。平衡后，IPG 胶条被放在第二向水平或垂直 SDS-PAGE 胶的表面。

( 1 ) 溶解 100 mg DTT ( Sigma-Aldrich ) 至 10 ml 平衡液中以配制平衡液 I 。

a. 为每根胶条准备 10 ml。

b. 将每根聚焦后的胶条放入一个试管（250 mm 长 ，内径 20mm) 中，在每个试管中加入 10 ml 平衡液 I 。

c. 试管用 Pamfilm 密封后在摇床上摇动 15 min，然后倒出平衡液。也可使用较短的平衡时间（10 min) ，不过这样做的风险是在样品进入 SDS-PAGE 胶时一些蛋白质可能不会从 IPG 胶条中出来。如果这样，应当在把 IPG 胶条从 SDS 胶上取下后将 IPG 胶条染色，以检查是否所有的蛋白质离幵了 IPG 胶条。

( 2 ) 溶解 0.4 g 碘乙酰胺（Sigma- Aldrich) 至 10 ml 平衡液中以配制平衡液 Ⅱ。

a. 为每根 IPG 胶条准备 10 ml。

b. 向每根胶条加入 10 ml 平衡液Ⅱ和 50 μl 作为 SDS-PAGE 指示剂的溴酚蓝（Serva) 溶液，再次轻轻摇动平衡 15 min。

( 3 ) 倒出平衡液Ⅱ，进行 SDS-PAGE ( 见 13.3.3 节）。如果用水平电泳槽（ 如 Muhiphor Ⅱ ) 进行 SDS-PAGE ，用去离子水短暂地冲洗 IPG 胶条，然后将胶条放在一张滤纸的一边，等待几分钟以吸净多余的平衡液。如果用垂直电泳槽（如 EttanDalt ) 进行 SDS-PAGE，用电极缓冲液短暂地冲洗 IPG 胶条。