氯霉素ELISA试剂
1 简介
本产品是用竞争酶联免疫反应原理来检测生物样本中的氯霉素含量。本试剂盒包含检测所需的所有试剂——包括标准品。
检测数量：96孔（包括标准品）
检测时间：20分钟
2 应用范围
本试剂盒可用于检测奶、组织（肌肉、肝脏、肾脏、虾类、蟹类、鱼类）、尿液、血液和饲料样本中的氯霉素。
3 原理
反应在包被了氯霉素抗体的固相微孔板上进行。标准品、样品和酶标物加入到微孔中，第一次温浴时，标准品或样品中的游离氯霉素分子与酶标记的氯霉素分子竞争结合吸附在固相上的抗体结合位点。没有结合的分子被清洗除去，通过加入显色底物来确定已经结合的酶的活性，酶使得无色的底物转变成兰色，加入反应终止液使得兰色变为黄色，用酶标仪在450nm处读出吸光度。颜色的深浅可以转换为样品中氯霉素的不同浓度。
4 试剂组成
微孔板：96孔（12×8，可分拆）直接包被氯霉素抗体
标准品：0.025ng/mL； 0.1ng/mL； 0.25ng/mL； 1ng/mL； 4ng/mL； 1ml含0.1ug/ml浓度的氯霉素标准品1瓶
酶标物冻干粉：玻璃瓶 1瓶
酶标物稀释液：13ml塑料瓶1瓶（棕色）
显色剂：13ml 塑料瓶1瓶（棕色）
终止液：13ml塑料瓶1瓶（白色）
清洗液10×：50ml塑料瓶1瓶（白色）
氯霉素样品稀释液10×：50ml塑料瓶1瓶（白色）
5 需要但未提供的材料
样品前处理需要：
－ 甲醇、乙酸乙酯、正己烷、异辛烷、三氯甲烷
－ 组织匀浆机、天平、水浴锅，摇床（振荡器）
－ 离心机，氮吹仪，混合振荡器
检测中需要：
－ 20～200ul移液枪和枪头
－ 50～200ul多通道移液枪和枪头
－ 配备450nm滤光片的酶标仪
－ 挤瓶
6 注意事项
－ 终止液含有硫酸，注意不要接触皮肤
－ 显色剂有毒，不要接触皮肤；如果接触请用水冲洗
－ 不要在有效期过后使用试剂
－ 不同批号的试剂不要混用
7 保存
－ 2～8℃保存，切勿冰冻
－ 没有使用的微孔条请务必用干燥剂保存在密封的袋子中
8 样品前处理
8.1尿样
8.1.1直接法
— 200µl尿样与800µl氯霉素样品稀释液混合
— 混合物在2000g，离心10min
— 取50µl上清用于检测
— 检测最终结果应乘以稀释倍数5
8.1.2抽提法
建议对“深色/不洁”尿样采用
— 1ml尿液用1M乙酸调PH值到4.8
— 加入25µl蜗牛液（Helix pomatia juice），37℃下温浴过夜或55℃下温浴2小时。
— 冷却至室温，并将PH值调节到7±0.5
— 加入2ml乙酸乙酯，混合1min。静置5-10 min分层。
— 将1ml上层液（乙酸乙酯层）转移到干净的试管中。
— 50℃，氮吹仪吹干
— 用200氯霉素样品稀释液溶解，混匀
— 取50µl用于检测
— 检测最终结果应乘以稀释倍数0.4
8.2 血清/血浆样品
— 1ml血清/血浆加入2ml乙酸乙酯混合1min，静置5-10min，令其发生相分离
— 取1ml乙酸乙酯于一新的试管
— 50℃，氮吹仪吹干
— 加入500µl氯霉素样品稀释液混合均匀
— 取50µl用于检测
— 检测最终结果应乘以稀释倍数1
8.3 奶
8.3.1
— 2000g，离心15min，去除上层脂肪
— 取50ul用于检测。
注意：检测酸奶时，应调样品PH值至中性。
8.3.2
— 取5ml牛奶样品于一试管中
— 2000g，离心15min，去除上层脂肪
— 取2.5ml脱脂奶于一新的试管
— 加入5ml乙酸乙酯，涡旋混合1min，静置10min
— 取4ml乙酸乙酯上层到干净玻璃管中
— 50℃，氮吹仪吹干
— 用200µl氯霉素样品稀释液溶解
— 取50µl用于检测
— 计算最终结果应乘以稀释倍数0.1
（脱脂奶粉处理方法：将60ml蒸馏水加入10g脱脂奶粉，再按上述步骤操作）
8.4蛋类样品
— 取1g匀浆全蛋
— 加入6ml乙酸乙酯涡旋混合1min
— 2000g离心10min
— 取3ml上层乙酸乙酯于一新的试管
— 50℃，氮吹仪吹干
— 加入1ml异辛烷/三氯甲烷（2：3，V/V），再加入500µl氯霉素样品稀释液，涡旋混合1min
— 2000g，离心10min
— 取50µl上层用于检测
— 计算最终结果应乘以稀释倍数1
注意：若上层乳化，可将试管置于80℃水浴约5min，并再次进行离心。
8.5 组织样品（肉类、肝脏、虾类、蟹类、鱼类）
方法一：
— 取3g匀浆样品
— 加入6ml乙酸乙酯涡旋混合，振摇10min
— 2000g，离心10min
— 取4ml乙酸乙酯上层于一新的试管
— 50℃，氮吹仪吹干
— 加入1ml异辛烷/三氯甲烷（2：3，V/V），再加入1ml氯霉素样品稀释液，涡旋混合1min
— 2000g，离心10min
— 吸取50µl上层用于检测。
— 计算最终结果应乘以稀释倍数0.5
注意：若上层乳化，可将试管置于水浴（80℃ ）约5min，并再次进行离心。
另：可以用正己烷代替异辛烷/三氯甲烷。若采用正己烷，离心后应完全去除上层正己烷，移取50µl下层用于检测。
方法二：用于虾、鱼、蟹类的大样品量处理
— 10g匀浆化样品与20ml乙酸乙酯混合10min
— 2000g，离心10min（或用滤纸过滤）
— 取10ml乙酸乙酯层于一新的试管
— 50℃，氮吹仪吹干
— 加入2ml异辛烷/三氯甲烷（2：3，V/V）（或2ml正己烷，参见方法一），并加入1ml氯霉素样品稀释液，充分混合。若发现乳化，可将试管在水浴（80℃）中加热（5min）。并将此溶液在2000g下离心10min。
— 利用巴斯德滴管转移上层清夜（若用正己烷，清夜则在下层）于清洁玻璃管中。
— 再加入1ml异辛烷/三氯甲烷（2：3，V/V）（或1ml正己烷）。混合上述溶液并离心分离如上。
— 吸取50µl上层用于检测（若用正己烷，清液则在下层）。
注：检测最终结果乘以稀释倍数0.2
8.6 蜂产品
8.6.1蜂蜜样品
— 3g样品与3ml蒸馏水充分混合
— 加入6ml乙酸乙酯充分振荡混合10min
— 2000g离心10min
— 转移4ml上层乙酸乙酯于一新的试管
— 50℃，氮吹仪吹干
— 残留物充分溶解于1ml氯霉素样品稀释液
— 吸取50µl用于检测
对于不纯净的蜂蜜应进行脱脂处理：
— 将氮流蒸发后的残留物溶于1ml异辛烷/三氯甲烷（2：3，V/V），加入1ml样品稀释液
— 涡旋混合1min，2000g，离心10min
注意：若上层乳化，可将试管置于水浴（80℃）约5min，并再次进行离心。
— 吸取50µl上层用于检测。
— 检测最终结果应乘以稀释倍数0.5。
另：可以用正己烷代替异辛烷/三氯甲烷。若采用正己烷，离心后应完全去除上层正己烷层，移取50µl下层用于检测。
8.6.2蜂王浆
— 1g蜂王浆与4ml抽提缓冲液（10.1g 1-庚烷磺酸，11.4g Na3PO4.12H2O。溶于1000ml蒸馏水中，用H3PO4调整pH2.0）混合30min
— 3000g离心10min
— 取2.5ml上清液用Oasis HLB柱（60mg Waters公司WAT094226）按以下固相抽提步骤纯化：
— 依次用1ml100％甲醇和1ml蒸馏水活化该柱（样品过柱前柱不能过干，否则需要重复活化）
— 将上述2.5ml上清液真空抽滤过柱
— 用3ml蒸馏水及3ml 50％（1：1；V：V）甲醇洗柱，真空干柱
— 用1ml100％甲醇洗脱，用干净玻璃管收集洗脱液
— 洗脱液在温和氮流下蒸发甲醇
— 样品残留物溶入0.5ml氯霉素样品稀释液中
— 吸取50µl用于检测
— 检测最终结果乘以稀释倍数1
注意：若无真空泵，可使用正压洗涤柱子；
流速均设定为1ml/min。
8.7 饲料样品
— 5g样品与20ml蒸馏水混匀
— 取5ml混合物到干净玻管中，加入10ml乙酸乙酯混合2min
— 2000g离心10min
— 转移5ml乙酸乙酯（上层）到干净玻管中，50℃温和的氮流下蒸发
— 残留物溶于0.5ml异辛烷/三氯甲烷（2：3，V/V），加入0.5ml氯霉素样品稀释液，混合液涡旋1min，
— 2000g离心10min
— 取50µl上层用于检测
— 检测最终结果应乘以稀释倍数1
注：若发现乳化，可将试管在水浴（80℃）中加热（5min），并将此溶液再次离心，吸取50µl上层清液检测
注意：本说明书提供的样品前处理方法仅作参考，实验人员可以根据自己的经验作改善以提高检测准确度。
9 工作液准备
为了避免污染，建议在配置标准品不要与试剂检测工作在同一室内进行，并使用不同的移液枪。
注意：整套标准品应该在每个检测实验前临时配置！！
氯霉素样品稀释液：用蒸馏水10倍稀释（1＋9），注意：如果出现结晶，请将溶液放于室温下摇动，重新完全溶解。
标准品配制：使用已经稀释的氯霉素样品稀释液。
-10ng/ml浓度：100ng/ml原始浓度溶液100ul +稀释液900ul（1:10）
-4ng/ml浓度：10ng/ml溶液400ul +稀释液600ul（1:2.5）
-1ng/ml浓度：4ng/ml 溶液 200ul +稀释液600ul（1:4）
-0.25ng/ml浓度：1ng/ml溶液200ul+稀释液600ul（1:4）
-0.1ng/ml浓度：0.25ng/ml溶液400ul+稀释液600ul（1:2.5）
-0.025ng/ml浓度：0.1ng/ml溶液200ul+稀释液600ul（1:4）
此氯霉素样品稀释液也应当用于B0孔。
酶标物：实验前用12mL酶标物稀释液溶解，并充分混匀。静置8小时（或过夜，但至少4小时），切勿涡旋混匀。
清洗液：用蒸馏水10倍稀释（1＋9）。注意：如果出现结晶，请将溶液放于室温下摇动，重新完全溶解。
显色剂：备用。
终止液：备用。
10 分析步骤
10.1 注意事项
－ 使用前请将试剂盒恢复到室温（20～25℃）
－ 使用后请立即将所有试剂放回2～8℃
－ 请不要改动分析步骤，尤其：
－ 不要在低于20℃条件下温浴
－ 要使用准确和精确的移液枪和适合的枪头
－ 一旦开始实验，完成所有步骤，不要中断
－ ELISA结果的重复性跟洗板的效果和一致性非常密切，请遵循操作方法
－ 不同的样品和标准品使用一次性枪头以避免交叉污染
－ 不要让枪头和微孔中的溶液或内避接触
10.2 检测程序
1. 用记录表记录B0，标准品和样品的位置，要求做双孔平行。
2. 加入标准品和样品：
－50ul氯霉素样品稀释液加入B0孔
－标准品或样品50ul加入微孔
3. 用多通道移液枪在所有微孔中加入100ul酶标物溶液。
4. 晃动酶标板。
5. 室温（20～25℃）下温浴10min。温浴过程中建议晃动酶标板2～3次。
6. 清洗步骤：
－ 倒去微孔中的溶液
－ 用挤瓶将所有微孔加满清洗液，然后倒去
－ 在吸水纸上拍打除去残留溶液
重复清洗四遍。
不要让微孔干燥。
7. 用多通道移液枪在所有微孔中加入100ul反应液。
8. 轻轻晃动酶标板。
9. 室温（20～25℃）下温浴10min。
10. 用多通道移液枪在所有微孔中加入100ul的终止液。
11. 轻轻晃动酶标板。
12. 在450nm下检测吸光度，结果在10min内读取最佳，30min内有效。
11 结果计算
－ 计算最大结合率（B0）、标准品和样品的平均吸光度
－ 根据以下公式来计算标准品和样品的结合率
＝B/B0 (%)
×100
标准品（或样品）吸光度
最大结合孔吸光度
－ 根据标准品的B/B0值在半对数曲线中画出标准曲线
－ 获得样品的B/B0值后在标准曲线上可以得到对应的氯霉素浓度值ppb（ug/kg或ug/L），实际浓度还要乘上稀释倍数。
12检测下限
组织 0.1ng/g
尿液和奶样 0.2ng/mL
13 特异性
分子
交叉反应％
氯霉素
100
琥珀氯霉素
92
氯霉素-葡萄糖苷酸
57
阿莫西林
< 0.1
14标准曲线模型
模型
