e抗原阴性慢性乙型肝炎患者血清表面抗原大蛋白水平...
e抗原阴性慢性乙型肝炎患者血清表面抗原大蛋白水平与乙肝型炎病毒DNA之间的关系
我国约1/3的慢性乙型肝炎患者乙型肝炎e抗原（HBeAg）阴性，但仍然伴有高水平的乙型肝炎病毒（HBV）复制[1]。在不能进行HBV DNA检测的单位，对这些患者HBV复制程度的判定难以进行。现探讨HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白（LHBs）与HBV DNA的关系，试图明确LHBs是否可以用作HBeAg阴性乙型肝炎患者病毒复制程度的判定指标。
一、资料与方法
1. 临床资料：629例HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者为北京地坛医院2003年7月-2005年8月门诊或住院患者，其中男340例，女289例，年龄19~72岁，平均43.2岁。标本采集时间点血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）均超过正常值上限。
2. HBeAg、LHBs检测：采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测。HBeAg检测试剂盒为Abbott公司产品，LHBs检测试剂盒为北京热景生物技术公司产品。LHBs检测临界值定义为吸光度值（A值）0.105，约相当于1 ng/μl，低于检测下限A值按照临界值半数计算。
3. HBV DNA检测：采用实时荧光PCR方法扩增，试剂盒为深圳匹基公司产品。PCR扩增仪为PE-7300（美国ABI公司）。HBV DNA检测下限为5×102拷贝/ml，小于5×102拷贝/ml视为HBV DNA阴性。
4. 统计学分析：采用统计软件SPSS10.0。计数资料组间差异采用卡方检验，计量资料组间差异采用方差分析。血清LHBs水平与HBV DNA对数值之间相关性采用相关分析。
二、结果
1. HBV DNA与LHBs阳性率：HBV DNA与LHBs检测结果见表1，其检出的一致率为76.6% [(279+203)/629]。629例HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者中，HBV DNA阳性率为54.4%（342/629），LHBs阳性率为57.7%（363/629），两者差异无统计学意义（x2=0.76，P＞0.05）。
表1 HBV DNA与乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白检测结果（例）
HBV DNA | 乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白 | 合计 | |
| 阳性 | 阴性 | ||
| 阳性 | 279 | 63 | 342 |
| 阴性 | 84 | 203 | 287 |
| 合计 | 363 | 266 | 629 |
2. 血清HBV DNA与LHBs水平之间的关系：279例HBeAg阴性但HBV DNA及LHBs阳性的慢性乙型肝炎患者血清中，LHBs含量与HBV DNA拷贝数对数值之间具有良好的相关性，相关系数（r=0.947，P＜0.01），方差分析显示不同HBV DNA拷贝数组之间，LHBs含量差异有统计学意义（F=138.0，P＜0.01）。不同HBV DNA拷贝数组之间LHBs变化范围见表2，变化趋势见图1。
表2 血清HBV DNA水平与乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白水平之间的关系
HBV DNA (拷贝/ml) | 例数 | 乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白 | |
| 阳性例数（%） | A值 | ||
| 102~ | 19* | 11 (57.9) | 0.257±0.252 |
| 103~ | 99 | 68 (68.7) | 0.534±0.487 |
| 104~ | 96 | 83 (86.5) | 0.604±0.578 |
| 105~ | 82 | 73 (89.0) | 0.875±0.688 |
| 106~ | 30 | 28 (93.3) | 1.266±0.873 |
| 107~ | 16 | 16 (100.0) | 1.393±0.856 |
| 合计 | 342 | 279 (81.6) | — |
注：*19例患者HBV DNA水平均＞5×102拷贝/ml
三、讨论
HBeAg是临床判定HBV复制程度及判断慢性乙型肝炎患者预后的重要指标之一，是抗病毒治疗终点判定的重要依据。目前对HBeAg阴性患者病毒复制程度的判断、抗病毒治疗终点的确定缺乏简要、有效的评估指标，尤其是不具备HBV DNA检测的基层医院，对HBeAg阴性乙型肝炎HBV复制程度无法判定，给临床治疗方案的确定带来了很大困难。
LHBs是HBV包膜的构成部分，尽管HBV与肝细胞结合的受体目前尚未完全明确，但HBV结合位点在LHBs已无争议[2,3]。现有研究显示，对肝细胞有直接毒性作用的HBV表达抗原中，也只有LHBs有直接的肝细胞毒性[4，5]。毛玻璃样变是感染HBV晚期非复制状态肝细胞典型形态学特征，Hsieh等[6]发现，pre-S1和pre-S2区突变导致HBsAg在内质网滞留并诱导内质网应激。LHBs对HBV复制过程具有反式激活作用，并与病毒颗粒从细胞内释放调节有关[7]。过量LHBs在肝细胞内质网积聚是导致内质网应激的关键因素[8]。
本研究表明，血清中LHBs含量与HBV DNA水平变化一致，具有良好的相关关系（r=0.947，P＜0.01），提示检测血清LHBs有助于HBeAg阴性患者体内HBV复制程度的判定。检测LHBs的酶联免疫检测方法操作简便，各级医疗机构都能开展，特别是在不能开展HBV DNA检测的基层医院，检测LHBs的临床意义更大。
HBeAg阴性乙型肝炎患者组中，13.4%（84/629）的患者检测结果为LHBs阳性而HBV DNA阴性，有3个可能的原因：（1）由于HBV具有适应性和变异性倾向，导致HBV基因变异频繁，已经设计好的商品化PCR引物有一定漏检率，而LHBs检测是采用单克隆抗体特异识别，受基因变异的影响较少。（2）含有LHBs的亚病毒颗粒（管状颗粒）的数量是完整病毒颗粒的10 000倍以上，血液中消退时间也晚于HBV DNA[9]。（3）近年来，抗病毒药物应用广泛，但是目前的抗病毒药物只能抑制HBV DNA复制，并不能抑制已经形成的病毒表达蛋白质，即并不减少前基因组RNA和mRNA，提示以病毒DNA为模板的转录和病毒蛋白的转译表达不受影响。因此血清HBV DNA下降的速度可能远快于LHBs。值得注意的是本研究中342例HBV DNA阳性和63例LHBs阴性患者中，多数为干扰素或核苷类似物抗病毒治疗中的患者，其LHBs持续阳性的意义我们还在继续观察中。同样是在HBeAg阴性患者中出现了10.0%。（63/629）的LHBs阴性而HBV DNA阳性的患者，可能的原因是HBV DNA检测灵敏度较高或是HBV基因前S区变异所致的LHBs漏检，对此我们也在做更进一步的观察。
研究结果显示，检测HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者血清LHBs，有助于对HBV复制程度的判断，但是否能够作为HBeAg阴性乙型肝炎抗病毒治疗终点的有效判定指标，值得深入探讨。
参考文献
1. Jia JD.Managenment of HBeAg negstive chronic hepatitis B.Zhonghua Ganzangbing Zazhi,2005,13:539.
贾继东.乙型肝炎e抗原阴性慢性乙型肝炎的治疗.中华肝脏病杂志,2005，13：539
2. Paran N,Cooper A,Shaul Y.Interaction of hepatitis B virus with cells.Rev Med Virol,2003,13:137-143.
3. Sung VM,Lai MM.Murine retroviral pseudotype virus containing hepatitis B virus large and small surface antigens confers specific tropism for primary human hepatocytes:a potential liver-specific targeting system. J Virol,2002,76:912-917.
4. Hildt E,Munz B,Saher G,et al.The PreS2 activator MHBs(t) of hepatitis B virus activates c-raf-1/Erk2 signaling in transgenic mice.EMBO J,2002,21:525-535.
5. Foo NC,Ahn BY,Ma X,et al.Cellular vacuolization and apoptosis induced by hepatitis B virus large suface protein. Hepatology,2002,36:1400-1407.
6. Hsieh YH,Su LJ,Wang HC,et al.Pre-S mutant surface antigens in chronic hepatitis B virus infection induce oxidative stress and DNA damage. Carcinogenesis,2004,25:2023-2032.
7. Bang G,Kim KH,Guarnieri M,et al.Effect of mutating the two cysteines required for HBe antigenicity on hepatitis B virus DNA replication and virion secretion.Virology,2005,332:216-224.
8. Chua PK,Wang PY,Lin MH,et al.Reduced secretion of virions and hepatitis B virus(HBV) surface antigen of a naturally occurring HBV variant correlates with the accumulation of the small S envelope protein in the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus.J Virol,2005,79:13483-13496.
9. Yamada T,Iwabuki H,Kanno T,et al.Physicochemical and immunological characterization of hepatitis B virus envelope particles exclusively consisting of the entire L (pre-S1+pre-S2+S )protein. Vaccine,2001,19:3154-3163.
