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【求助】关于realtimePCR条件如何摸索？
【求助】关于realtimePCR条件如何摸索？
各位大虾！
最近一直在做realtime PCR, 由于是叫公司做，先期摸条件都是他们在弄，自己很少能参与进去，但等到分析结果时发现了很多问题，却又不知道该如何解决DeadDead
问题一：
我需要跑好几个基因，但公司跑的时候都用一个条件，说是增加基因之间的可比性，而且都用两步法，即94℃2分钟预变性，然后93℃10秒, 60℃40秒共40个循环，，但这样跑出来的结果是有几个基因如GAPDH是好的，但有几个就不行，出峰都很迟，且阳性对照都做不出来，明显是不对的。和公司的技术人员联系，他们说这样做是有道理的，因为两步法可以保证TAQ酶的活性，使结果更灵敏，且他们认为只要标准品跑得好就说明条件是好的。
但我也问过其他人，有说是标本应该另行摸条件的，而且应该跟普通PCR一样用跑胶的方法摸好了再去跑。
现在我的问题是到底应该怎样来摸索realtime PCR的条件？Question
问题二：
除了PCR程序外，还有PCR体系问题，现在我的体系是40ul，其中dNTP 200pmol/ul，引物各0.600 pmol/ul，荧光探针0.25pmol/ul, Taq酶2 u, cDNA 模板4 ul，也就是探针每个反应用10pmol，引物用24pmol.其实这样做是很浪费引物和探针的，不知能否再优化一些？
问题三：
还有，我发现做realtimePCR反应不同锅之间的差距很大，是否应该让所有的TEST都在一个锅里做才行，在做目的基因的同时是否每锅都得同时跑GAPDH？？
难过ing!!
ConfusedConfused
各位高手千万给个解答啊
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最新回复
H2O (2015-6-01 17:03:12)
[ 本帖最后由 H2O 于 2015-6-1 17:25 编辑 ]
xevin (2015-6-01 17:26:00)
ask the company that synthsiye the primer for u.
and the first queation, i think u have receive my mail?
dior (2015-6-01 17:27:04)
相关疾病：
白血病
我们实验室GAPDH的Program：95度300s，95度20s，60度20s。
体系30ul，用的是Z－TAQ，Z-TAQ buffer(30nM Mgcl2)3ul, z-dNTP2.4ul,10pmoll/l的两种引物个2.5ul,primer2ul,z-taq 0,3ul, 水12.3ul,DNA or cDNA5ul.因为这是我们这里白血病的常规检查GAPDH，所以这个条件应该是很优化的。你可以试一下。
用Taqman系统通常都用2步法，这点不用置疑。另外，如果能把GAPDH的程序调的跟目的基因的程序一样当然好，样本不多时，一锅就可以出来，但是很多时候这样是行不通的。
如果你想重新作优化，重新定程序，能在real tiime上跑最好，但是很费试剂。最好是调整程序用普通PCR，优化体系用real time. 将样本稀释成不同指数级，一般是从10的0次方到10的4次方，选取反应效率在1左右的条件。
如果程序和体系的反应效率很好，应该是很稳定的，不同锅之间的差别不应该很大，同一样本的CT值相差最多1左右。
我可以把我手头的一些protocol发给你。另外设计探针，订货是我只写探针序列和5‘端FAM，剩下的告诉公司怎么好怎么做
xevin (2015-6-01 17:27:35)
楼上的大侠，可以将protocol发给我吗？我们正准备做定量pcr！
谢谢
tie8 (2015-6-01 17:29:01)
不同意主任的看法; 意见如下。
1。 mg2+， realtime PCR 不应该小于5 mM (一下都是反应终浓度）
2。 dNTP 不小于400nM
3. primer 不小于400nM
4. probe 建议200nM
你的GAPDH每次都好， 是因为公司已经将她优化到极点
你的基因反应不好， 是因为1。 primer 没有设计好。2。 taqman探针没有设计好。
以上两个设计， 在Taqman-realtime PCR反应里息息相关， 不是1000-2000人民币能解决的
一个好的探针就要300US$, 你自己考虑一下， 那个公司收你多少， 他们能做多少
有问题， wbai@rogers.com, 很乐意交换意见
tie8 (2015-6-01 17:29:26)
H2O (2015-6-01 17:30:57)
我做了大量的PCR优化工作，主要是关于镁离子的，浓度从2到5.5mM，我的两种基因一种4.0下最优，一种4.4下最优。用的是质粒DNA从10的0次方到10的4次方，两个平行管，做9次，优化标准：扩增效率在0.98以上，R2在0.99以上。用taqman一般都需要做优化PCR这一步。
关于其他成分的浓度，刚开始我也是按照公司或其他资料建议的浓度，但是结果不稳定，后来同事建议我用一个现成的protocol,先优化Mg，如果有问题再调整。
我现在的两种基因都不符合你说的，但是反应很好，质粒DNA的标准曲线扩增效率为0。98和0。99，R2在0。995以上。
H2O (2015-6-01 17:31:27)
H2O (2015-6-01 17:31:48)
1. length:64bp
PCR BUFFER 10* （5mM Mgcl2） 3ul
Mgcl2 25mM 3,5ul
dNTP 25mM 0,35ul
sense primer 10pmol/ul 2,5ul
antisense primer 10pmol/ul 2,5ul
probe 10pmol/ul 2ul
hotstar 0,25ul
water up to 20ul
cDNA or DNA 10ul
2. length:94bp
PCR BUFFER *10 15mM Mgcl2 3ul
Mgcl2 25mM 3ul
dNTP 25mM 0,35ul
sense primer 10pmol/ul 2,5ul
antisense primer 10pmol/ul 2,5ul
probe 10pmol/ul 2ul
普通Taq(Roche ) 0,25ul
water up to 20ul
cDNA or DNA 10ul
Program: 95oc 600s
94oc 15s
62oc 60s
40cycles
我的内参用的是ABL，protocol与1。一样，program也一样。
事实上，除了镁离子之外，到现在我也没有算过其他成分的终浓度，但是体系很好很稳定，可能是我的幸运之处。
近两个多月，我一直在做RT-PCR系统优化，这个工作真是很痛苦，跑了都有上百遍realtime PCR了。而且当系统扩增不好时，有时自己也不知道是哪里出了问题。体会最深的：1.镁离子的优化，当从2mM做到5.5mM时，可以很明显看到扩增效率从低到高再到低的过程。但是工作量很大。
2. Taq 酶，没有任何一种taq适用于全部。我的l两个体系刚开始都用hotstar，结果一个体系怎么优化扩增效率只有0.7左右，换了taq后，扩增效率一下提高到0.95以上。
3. 退火温度： 两种基因taqman系统我从56做到64度，有点失之毫厘谬以千里的感觉，温度相差一两度，扩增效率可以有天壤之别。
4.对于引物和探针，两个引物只要能扩增出目的基因就算是符合基本要求了。事实上我的两个引物设计不是太好，Tm相差有点大，在Taqman系统没有太大麻烦，但是在SYBRGREEN系统中寻找退火温度时遇到不少困难，但是只要有耐心，是可以找到最优的体系的。
欢迎讨论！
whitesheep (2015-6-01 17:32:08)
做了realtime pcr才发现有那么多问题。
在PE7000上，有threshold 和baselin两种分析方法。据ABI公司的专家培训，认为在分析的时候，或者选用threshold ，或者选择baseline来进行分析。如果选择threshold 以后，再选择baseline的范围，则仪器会根据后者的方法来计算（根据baseline的10倍标准差来计算域值），如threshold的选择在后，则根据threshold来计算。但是，我们发现，threshold的选择位置不同，即使采用同样的baseline进行分析，最后的CT值差异比较大。不知大家对这个问题是怎么解决的。
另外，在体系的优化过程中，不知大家采用怎样的优化过程，1.反应条件；2.模板浓度；3.引物和探针的浓度；4..Mg2+浓度；还是其他，我觉得，模板对结果的影响很大，在摸条件的时候，如果模板不稳定，则重复性也很不好！
milkdog (2015-6-01 17:33:13)
我的片段已小于100bp，亦发现Mg++的影响还是很大的。但退火温度不要小于59C为好。
ha111 (2015-6-01 17:33:34)
谢谢各位高手指点，这里向大家有礼了！Smile
目前跑细胞株药物作用后的基因表达趋势，觉得real-time还是能做出一点趋势来的，虽然不同锅之间的差异问题还是存在，但是我只有通过不断的重复来肯定所得的结果。不过，我不知道如果要发文章，怎样才算是有科学性的？是给一条曲线，上面标出复管之间的误差线呢，还是发至少三条曲线上去，说明结果是solid的？QuestionQuestion
以我的经验觉得，realtime在结果的可信性上确实存在问题，一次结果实在不能说明问题，我看3次也未必能够。因为实在太不容易稳定了，不同锅之间根本不可能进行统计分析，所以我觉得realtime的统计和传统的PCR肯定是不一样的，比如如何进行临床标本检测的统计？如何进行实验研究的统计。我指的不是简单的阳性阴性，而是数值上的变化和变化所赋予的意义，这点我非常想得到高手的指点！！
dior (2015-6-01 17:34:34)
veiwu (2015-6-01 17:34:50)
现在国内有做BHQ标记的吗？什么价钱，据说效果还是不如TEMARA.
veiwu (2015-6-01 17:36:21)
QUOTE:
最常用的还是5fam,3tamera.不同的荧光染料的稳定性受PH值影响不同。跟仪器的要求也有关系purrr (2015-6-01 17:36:42)
你设计的探针和引物从来没出现过问题吗？
H2O (2015-6-01 17:38:35)
我作taqman没有遇到过这种情况，但是在SYBR Green中遇到过第一种现象，跟基因量和其在指数增长期的位置有关。我见到的大多数基因在quantitation data中从基线穿出就是指数曲线的模样了，但是我的一个基因从基线出来所有样本都是缓慢增长，到了norm fluoro10的－2次方才开始成为指数模式，但是范围比较窄，到了10的0次方就结束了（可能就是到了你所说的平台期），我想可能是因为最初基因的量没有达到指数增长期。至于基因的指数增长期，我想跟基因本身和系统都有关系（包括引物和探针）。我也只是猜，没有得到任何证实。
你的第二种现象我不太明白，是不是系统的反应效率低？
关于引物和探针，很幸运，我还没有遇到过太大的问题。通常我的引物都是取自别人的文献，如果查不到，老板不让我用任何引物设计软件，必须自己设计。我的一对引物用的是文献上的，但是Tm值相差很大。我在做标准曲线时，寻找退火温度成了大问题，只好一度一度的试，一段时间也是怎么试都不行，结果极不稳定，扩增效率怎么都不好。我也觉得是引物出了问题，准备换。但是后来我用rRNA稀释质粒DNA增加其稳定性，结果系统比较好了。之后我总结是由于DNA的反复冷冻溶解是其破坏引起的。
关于引物和探针这方面，我的却是没有什么经验，体会也不是很深，还需要向你多多请教。
ending (2015-6-01 17:39:13)
用rRNA稀释质粒DNA增加其稳定性？有相关文献吗？我也想学学。“由于DNA的反复冷冻溶解是其破坏引起的”这个问题在座pcr时是很严重的问题吗，我那个基因的第一个引物和探针就是取自别人的文献，结果如我上面所说，没办法，我运气不好。
看你的pcr条件的摸索，看来我那个基因的问题到你手上，肯定可以解决问题。你是怎么单位来着？
H2O (2015-6-01 17:44:15)
我说说我的第一个引物，那是刚刚开始接触分子生物，几乎一无所知，看到文献上的就买来用，结果引物中有TTT和AAA，这是违反引物设计原则的，但是买来就用吧，没想到出产物了，我把产物测序后也没有问题。后来那这对引物做real time，退火温度怎么都调不好，不是效率不好就是no template control里有信号。一看才发现一个Tm是58度，另一个是66度。当时我觉得这对引物不行了，想换。但是一想到换了引物还要重新做测序，我还是再试试吧。当时我也意识到DNA破坏对实验的影响，就只用新稀释的质粒，居然系统慢慢稳定下来了。我想我的这对引物问题这么多居然还能把系统建立起来，一方面是我比较有耐心，可能更大的是运气好吧。
caihong (2015-6-01 17:44:32)
你的第一个引物这么的差，你都能作出好的结果，不得不佩服。你的现成的protocol是怎么样的能给我发一个吗？shiguiwang@hotmail.com
我还有好几对扩的不是很的引物和探针，我的引物探针扩增不好的主要表现是反应效率很低，并且平台期的荧光强度是本底荧光的2倍都不到，能谈谈你的方案吗？
【求助】关于realtimePCR条件如何摸索？