【综述】脂肪组织巨噬细胞：免疫治疗肥胖的新靶点？
一、引言
巨噬细胞广泛分布于人体多个组织器官，它能识别外来病原体，在固有免疫、炎症反应中发挥重要作用。1993年Hotamisligil等发现肥胖动物模型脂肪组织的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)分泌增加，首次将肥胖与炎症相联系，直到2003年Xu等和Weisberg等发现肥胖动物模型的脂肪组织存在大量巨噬细胞浸润，从此开启了脂肪组织巨噬细胞(adipose tissue macrophages， ATM)与肥胖相关性的研究。大量研究提示巨噬细胞是脂肪组织最主要的炎症细胞，在肥胖引起的胰岛素抵抗中起到关键性作用。据统计，世界上肥胖人数超过10亿，肥胖日益成为全球关注焦点，而肥胖发生过程中巨噬细胞的病理生理作用还未完全阐明。本文总结了近年来对ATM在肥胖中的免疫学致病机制的研究，并阐述ATM与胰岛素抵抗之间的密切关系，旨在为肥胖的免疫学治疗提供新靶点。
二、肥胖与ATM浸润
肥胖患者或动物模型的白色脂肪组织中存在巨噬细胞浸润。Xu等[3]首先发现ob/ob小鼠、db/db小鼠或高脂饮食诱导(high fat diet，HFD)肥胖小鼠白色脂肪组织的巨噬细胞相关基因表达水平升高，脂肪组织免疫组化进一步提示F4/80＋细胞(小鼠巨噬细胞标记物)占脂肪组织的比例明显升高(肥胖小鼠ATM和正常对照小鼠的比例分别为41%±4%与12%±2%， P<0.005)，并与脂肪细胞平均横截面积正相关[4]。本研究组亦发现高脂饮食小鼠附睾旁脂肪的巨噬细胞比例升高，且巨噬细胞比例随高脂饮食的时间延长而增加[6]。肥胖患者多个部位的脂肪组织也发现该现象，且内脏脂肪比皮下脂肪组织中的巨噬细胞浸润更为严重，前者与体重指数或腰围的相关性显着高于后者，提示内脏脂肪和肥胖的关系更为密切[7]。
三、ATM增加的途径
正常小鼠和人的脂肪组织中的巨噬细胞称为组织固有巨噬细胞(resident macrophage)，为分散于脂肪组织的小圆形细胞，参与维持脂肪组织的稳态[1，4]。肥胖发生时，ATM的数量剧增[4]。了解ATM的来源对以ATM为靶向的药物研发至关重要。根据近年研究，ATM增加的途径如下。
1．ATM的募集：
急性感染的组织同样存在巨噬细胞浸润，一般认为炎症发生时，粒细胞集落刺激因子和趋化因子刺激骨髓紧急造血，释放大量中性粒细胞和单核细胞入外周循环，组织局部的趋化因子吸引外周循环中经典的Ly6Chi单核细胞穿过血管内皮，迁入组织，分化为巨噬细胞和树突状细胞，造成局部巨噬细胞浸润，该过程称为巨噬细胞的募集[1]。
肥胖时ATM浸润的机制与之类似。肥胖动物模型和患者存在骨髓增生和外周单核细胞增加。有研究发现ob/ob小鼠骨髓造血细胞明显增生，伴外周单核细胞数升高，肥胖患者也发现类似现象，而减重手术能降低患者外周单核细胞的数量和百分比，这提示脂肪组织可能可进一步影响骨髓及外周单核细胞数量[8，9]。此外，小鼠异体骨髓移植实验证明肥胖小鼠85%的ATM来源于骨髓[4]。Oh等[10]将标记PHK26荧光染料的单核细胞注入肥胖小鼠外周循环后，肥胖小鼠脂肪组织内出现PHK26＋细胞，且其比例高于对照组，进一步证实ATM由外周循环迁入组织。ATM数量受趋化因子的影响，多个研究发现肥胖患者和小鼠脂肪组织的趋化因子增加。趋化因子对脂肪细胞募集巨噬细胞有关键作用。多数学者认为脂肪组织趋化因子增加是ATM浸润的始发事件之一，营养过剩导致脂肪细胞增生和过度膨胀，造成局部缺氧和内质网应激，刺激脂肪细胞分泌趋化因子，募集单核细胞至脂肪组织，导致巨噬细胞浸润。聚集的ATM本身也表达趋化因子，形成恶性循环[11]。下面将重点论述几种趋化因子。
单核细胞趋化因子(monocyte chemoattractant protein-1， MCP-1)及其受体CCR2(CC chemokine receptor 2)是研究最多的趋化因子及受体。本研究组实验发现肥胖小鼠附睾脂肪组织MCP-1的表达较正常组上调约7倍，肥胖患者也发现类似现象[7，12]。基因敲除或过表达实验提示MCP-1和CCR2显着影响ATM的浸润和胰岛素抵抗[13，14]。动物实验发现肥胖小鼠脂肪组织的趋化因子CXC受体3(chemokine C-X-C motif receptor 3， CXCR3)、趋化因子CXC受体12(chemokine C-X-C motif ligand 12， CXCL12)、CC趋化因子受体5(CC chemokine receptor 5， CCR5)基因表达水平上调，敲除CXCR3、CCR5或阻断CXCL12配体趋化因子CXC受体4(C-X-C motif chemokine receptor 4， CXCR4)肥胖小鼠的ATM含量均明显下降，伴糖耐量或胰岛素敏感恢复，提示多个趋化因子参与ATM浸润[15，16，17]。
趋化能力并非仅限于趋化因子及趋化因子受体系统，有研究发现class 3 semaphorin E (Sema 3E)和其受体plexin D1也对ATM募集起重要作用，它是一种胚胎神经和心血管系统发育的神经导向分子，在HFD肥胖小鼠的脂肪组织Sema3E-plexinD1通路表达上调[18]。
以上种种证据均提示，骨髓来源的单核细胞在趋化因子的作用下迁入脂肪组织，造成ATM浸润。除了影响脂肪组织局部趋化因子的大量表达外，聚集的ATM本身也足以进一步诱导骨髓增生[8]。有研究报道将肥胖小鼠的内脏脂肪移植到正常小鼠可诱导后者出现单核细胞增多症。研究发现ATM表达的S100A8/A9蛋白可能参与该过程，该蛋白可激活Toll样受体4(Toll-like receptor 4， TLR4)-髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88， MyD88)信号通路和NOD样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-leucine-rich repeats containing pyrin domain 3， NLRP3)炎性体，从而促进ATM分泌白细胞介素(IL)-1β至外周循环，刺激骨髓增生，造成恶性循环[8]。
2．ATM的增殖：
Amano等[19]给ob/ob小鼠注射氯膦酸二钠脂质体，以消除80%以上的外周单核细胞，却发现ATM数量并未下降，说明ATM的数量维持并不仅依赖于外周单核细胞。肥胖患者和动物模型也存在ATM增殖活跃。Ki67是一种在细胞周期活跃时表达的蛋白，ob/ob小鼠内脏脂肪组织Ki67＋巨噬细胞的比例比对照组高4倍，肥胖患者皮下脂肪组织的Ki67的基因表达约为正常对照组的2.5倍，并主要围绕在坏死的脂肪组织周围[19，20]。外周单核细胞的募集可能在肥胖初期、巨噬细胞数量剧增时起主要作用，当募集外周单核细胞不足以满足局部ATM数量时，原位增殖是维持ATM数量的重要方式。
3．ATM的蓄积：
生理情况下，随着急性炎症的消退，巨噬细胞逐渐从炎症组织迁移至外周淋巴结，长期慢性炎症可能与巨噬细胞迁出能力受损有关。研究者首先在动脉粥样硬化中发现，巨噬细胞蓄积是斑块慢性炎症的重要机制，低氧环境能诱导人和小鼠动脉粥样硬化斑块的泡沫细胞表达Nertin-1及其受体Unc5b，这种神经导向分子能阻断趋化因子对巨噬细胞的定向迁移，导致泡沫细胞在动脉壁内蓄积[21]。与动脉粥样硬化类似，肥胖者的脂肪组织也存在低氧和巨噬细胞浸润，肥胖患者和小鼠ATM亦高表达Nertin-1和其受体Unc5b，基因敲除Nertin-1的肥胖小鼠的ATM数量比对照组低50%，而外周淋巴结的巨噬细胞数量高于对照组[22]。提示Nertin-1参与的巨噬细胞蓄积是ATM长期浸润的机制之一，恢复巨噬细胞的定向迁出是改善胰岛素敏感性的潜在治疗靶点之一。
四、ATM的极化
巨噬细胞在不同的微环境中呈现较大可变性，一般将巨噬细胞分为经典活化型(又称M1型)和替代活化型(又称M2型)。这种命名衍生于Th1和Th2型免疫反应，Th1型免疫反应的干扰素γ(interferon gamma， IFN-γ)等细胞因子可刺激巨噬细胞向M1型活化，而Th2型免疫反应的IL-4和IL-13激活信号转导子和转录激活子6(singnal transducers and activators of transcription 6， STAT6)以诱导M2型活化[23]。M1型和M2型均表达F4/80、CD68和CD11b，但M1型巨噬细胞为CD11c＋而M2型巨噬细胞CD11c－。常见的M1型巨噬细胞表达基因有一氧化氮合酶2(nitric oxide synthase 2， Nos2)等，而M2型巨噬细胞表达精氨酸酶1(arginase-1， Arg1)、几丁质酶3蛋白3(chitinase 3-like 3， Ym1)、CD301等[1，23]。目前并没有一种表面标记物能够确切区分人类的M1型和M2型巨噬细胞，准确的区分需要多种细胞标志物的组合。除了细胞标志物和表达基因的差异外，M1和M2型巨噬细胞的生物学特性也不同，M1型巨噬细胞通过分泌IL-6、TNF-α等促炎因子参与消除病原体，M2型巨噬细胞通过分泌IL-10和生长因子起抑制炎症、组织修复和维持脂肪组织生理功能等作用[1]。
肥胖时ATM向M1型巨噬细胞极化。多个研究发现正常小鼠的ATM以CD11c－巨噬细胞为主，CD11c＋巨噬细胞仅占ATM的9.3%，当肥胖发生时，每单位质量脂肪组织的CD11c＋巨噬细胞数量增加5.5～20倍，而CD11c－巨噬细胞无明显差别[24，25]。ATM基因表达提示，CD11c＋巨噬细胞类似M1型，其炎性基因的增加表达(如诱导型一氧化氮合酶、IL-6、TLR4)，而CD11c－巨噬细胞表达Ym1，表型类似M2型巨噬细胞[24，25]。剧增的CD11c＋巨噬细胞主要由外周单核细胞募集而来，聚集在坏死的脂肪细胞周围，部分形成多核巨细胞，细胞质内有吞噬的脂滴，它与坏死的脂肪组织一起形成冠状结构(crown-like structures)，而CD11c－巨噬细胞为脂肪组织的组织固有细胞，分散于组织间隙[25，26]。
目前多数文献仍采用M1、M2型的二分类法归纳ATM特性。但实际上体内的ATM呈现出复杂、独特的连续表型谱。Kratz等[27]发现肥胖患者ATM并不表达人慢性感染性炎症中经典活化的M1型巨噬细胞的标记物。高糖、高脂、高胰岛素环境诱导活化的巨噬细胞和病原体刺激活化的巨噬细胞的基因表达并不相同，比如前者比后者表达更高水平的三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ATP binding cassette transporter A1， ABCA1)和更低的CD206。以上研究提示，不能简单地将代谢异常环境中活化的CD11c＋巨噬细胞等同于感染性炎症激活的M1型巨噬细胞，它们可能存在不同的活化机制。关于肥胖发展过程中巨噬细胞表型变化和对应的功能还有待研究，目前对人类巨噬细胞谱缺乏统一的标记物，也尚不明确巨噬细胞标记物的表达所涉及的细胞信号通路，这限制了研究的开展。
五、ATM与胰岛素抵抗的关系
ATM是脂肪组织最主要的炎症细胞，近来许多研究通过基因敲除技术建立动物模型，探索ATM和胰岛素抵抗的因果关系以及影响ATM活化状态的细胞因子。
1．M1型巨噬细胞介导胰岛素抵抗：
研究发现，M1型巨噬细胞加重胰岛素抵抗，利用基因敲除HFD小鼠CD11c＋ATM即出现脂肪组织炎症减轻和胰岛素抵抗的改善[28]。基因敲除Ccr2的HFD小鼠的CD11c＋ATM数量明显下降，伴随脂肪组织炎症基因表达下降和胰岛素抵抗的改善[13]，可见脂肪组织的CD11c＋ATM浸润是胰岛素抵抗的原因之一。
M1型巨噬细胞参与胰岛素抵抗的机制与升高的游离脂肪酸(free fat acids， FFAs)有关，FFAs可能是ATM加重胰岛素抵抗的始发因素。Fetuin-A是一种肝脏分泌的糖蛋白，肥胖时其血浆浓度升高[29]。在Fetuin-A介导下，FFAs能间接地激活CD11c＋ATM的TLR4，使TLR4下游的核因子-κB抑制蛋白激酶β/核因子-κB(IKKβ/NF-κB)和c-Jun氨基末端激酶-活化蛋白1(c-Jun N-terminal kinase/activator protein 1， JNK/AP-1)炎症信号通路磷酸化，导致细胞的炎症基因表达增加，并分泌更多的TNF-α、IL-6、MCP-1等炎症因子，也有研究发现FFAs亦激活ATM的TLR2参与胰岛素抵抗[24]。生理情况下，胰岛素通过胰岛素受体介导使胰岛素受体底物(insulin receptor substrate， IRS)的酪氨酸磷酸化，从而激活下游的磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(phosphoinositide 3-kinase/AKT serine/threonine kinase， PI3K/Akt )信号通路，促进细胞对葡萄糖的摄取，发挥胰岛素的降糖作用。但活化的IKKβ和JNK能使IRS的丝氨酸磷酸化，阻断IRS的酪氨酸磷酸化和下游的PI3K/Akt通路，导致胰岛素抵抗[30]。另外，巨噬细胞分泌的炎症因子，如TNF-α，能进一步激活IKKβ/NF-kB、JNK/AP-1、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin， mTOR)等炎症通路，形成恶性循环[31]。
饱和脂肪酸也参与胰岛素抵抗，肥胖时过量的饱和脂肪酸能抑制巨噬细胞表达CGI-58(comparative gene identification-58)，该蛋白具有调控线粒体功能的作用[32]。动物实验发现，敲除肥胖小鼠巨噬细胞的CGI-58基因后，ATM出现线粒体功能失调和活性氧簇介导的氧化应激，导致NLRP3炎性体和下游的caspase-1的活化，伴胰岛素抵抗和高血糖的加重[32]。NLRP3炎性体是一种细胞胞质内的蛋白复合物，为Nod样受体(the Nod like receptor， NLRs)家族中的一员，在肥胖糖尿病患者脂肪组织的表达增加[33]。活化的NLRP3炎性体和下游的caspase-1并不影响脂肪组织M1/M2的比例，但能促进IL-1β和IL-18分泌，导致胰岛素抵抗[33]。
2．M2型巨噬细胞能改善胰岛素敏感性：
与M1型相反，脂肪组织M2型巨噬细胞分泌抗炎因子IL-10能抑制炎症和改善胰岛素抵抗[34]，因此M2型巨噬细胞的活化因子也间接影响胰岛素敏感性。比如过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR-γ)是一种脂肪酸的感受器，在脂肪组织M2型巨噬细胞中广泛表达。只有在其作用下，IL-4才能激活STAT6，诱导髓系细胞的线粒体生物合成和脂肪酸氧化，PPAR-γ介导单核细胞向M2型巨噬细胞活化[35，36]。基因敲除肥胖小鼠巨噬细胞PPAR-γ后，其脂肪组织M2型巨噬细胞的相关基因表达水平降低70%～80%，而M1型巨噬细胞的炎症基因表达升高，伴胰岛素抵抗和高血糖的加重[35]，提示PPAR-γ对M2型巨噬细胞表型的维持和恢复胰岛素敏感性有重要作用。另一种与M2型巨噬细胞表型密切相关的细胞因子是Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4， KLF4)，它是转录因子锌指结构的一种亚型。与PPAR-γ类似，KLF4能协同IL-4激活STAT6，抑制NF-kB信号通路，同时具有活化M2型巨噬细胞和抑制M1型巨噬细胞的作用[37]。敲除肥胖小鼠巨噬细胞的KLF4将导致肥胖小鼠脂肪组织的M2型巨噬细胞比例下降和胰岛素抵抗、高血糖的恶化[37]。与正常人相比，肥胖患者皮下脂肪组织的KLF4表达水平下降了50%，这可能是脂肪组织内M1/M2比例升高的原因之一[37]。
3．ATM与体重改变：
有研究利用活体多光子显微成像技术动态观察高脂高糖喂养的小鼠ATM的迁移，发现CD11c＋ATM浸润和迁移速度增加为肥胖初期事件，早于HFD小鼠体重改变[38]。前文已述，去除肥胖小鼠M1型巨噬细胞能恢复其胰岛素敏感性，但与对照组相比，其体重并无统计学差异[28]，提示M1型巨噬细胞不依赖于体重介导胰岛素抵抗。大部分研究亦提示脂肪组织M1型巨噬细胞的数量改变不伴随体重变化，比如MCP-1过表达的HFD小鼠脂肪组织M1型巨噬细胞显着增加伴胰岛素抵抗，反之，敲除MCP-1的HFD小鼠M1型巨噬细胞数量下降伴胰岛素敏感性恢复，但这两种基因型小鼠的摄食量和体重均较野生型HFD小鼠无异，与之类似的肥胖小鼠模型还包括CXCR3－/－小鼠、CCR5－/－小鼠、Sema3eKo小鼠等[14，15，17，18]。有研究报道CCR2－/－HFD小鼠(M1型巨噬细胞显着降低)体重较野生型HFD小鼠下降15%，可能是与该模型小鼠的摄食下降有关，与体重匹配的对照组相比，CCR2－/－HFD小鼠的胰岛素抵抗仍明显改善[13]。这提示肥胖时M1型巨噬细胞的浸润不影响或仅轻微影响体重。然而M2型巨噬细胞与M1不同，Mac-PPARγKO的HFD小鼠(巨噬细胞特异性敲除PPARγ)或MyeKO的HFD小鼠(髓系细胞特异性敲除KLF4)脂肪组织M2型巨噬细胞数量显着下降，伴随更严重的胰岛素抵抗和体重、脂肪总量的增加，基因表达提示β氧化相关基因表达下降，提示M2型巨噬细胞可能参与脂肪酸氧化，具有减重作用，增加M2型巨噬细胞比例为治疗肥胖的潜在靶点[35，37]。
六、M2型巨噬细胞介导白色脂肪棕色化
除了分泌抗炎因子IL-10，脂肪组织的M2型巨噬细胞还对白色脂肪棕色化起关键作用。棕色脂肪主要分布于啮齿类动物和婴儿，特征性地通过解耦联蛋白1(uncoupling protein 1， UCP-1)介导产热。在长期寒冷或β肾上腺素受体激活物刺激下，白色脂肪组织也可以出现高表达UCP-1的细胞，与棕色脂肪细胞相似却不同，称为米色脂肪，该过程称为白色脂肪棕色化[39]。棕色脂肪和米色脂肪参与适应性产热，具有减重和改善胰岛素抵抗的作用，是近年肥胖治疗的研究热点。M2型巨噬细胞对寒冷诱导米色脂肪起重要作用，低温环境中小鼠白色脂肪的M2型巨噬细胞增加，而M1型比例不变[39，40]。这些增加的M2型巨噬细胞可能由外周CCR2＋单核细胞招募至脂肪组织，在嗜酸性粒细胞分泌的IL-4、IL-13(Th2型免疫反应细胞因子)作用下向M2型巨噬细胞活化[41]。小鼠受冷刺激时，M2型巨噬细胞分泌大量去甲肾上腺素(约占总量50%以上)，诱导白色脂肪棕色化，促进脂解，增加产热[40]。IL-4/13－/－小鼠的米色脂肪生成受到抑制，而为处于常温中(30℃)的小鼠注射IL-4能增加皮下脂肪组织的M2型巨噬细胞和UCP-1基因表达，提高小鼠在冷环境中的总产热能[41]。
van Marken等[42]发现，不同的室温下，年轻肥胖患者的棕色脂肪活性低于体重正常患者，提示肥胖患者的棕色脂肪和诱导米色脂肪的能力受损。动物实验也发现HFD小鼠皮下脂肪组织的UCP-1蛋白和合成儿茶酚胺的相关酶基因表达显着降低[41]。与之类似，注射TNF-ɑ的正常小鼠的脂肪组织UCP-1基因表达也受抑制，而用氯膦酸二钠脂质体消除HFD小鼠脂肪组织的M1型巨噬细胞可恢复UCP-1的基因表达[43]，提示肥胖时局部炎症反应和ATM向M1型极化可能是棕色和米色脂肪组织受抑制的原因之一。
M2型巨噬细胞对诱导白色脂肪棕色化至关重要，为潜在治疗靶点，目前已在肥胖动物模型上开展相关研究。前文提及Th2型细胞因子如IL-4能作用于巨噬细胞内的IL-4Rɑ，使单核细胞向M2型活化[41]。有研究者将目光投向Th2型细胞因子，为肥胖小鼠模型注射IL-4能提高HFD小鼠脂肪组织的产热基因表达(包括UCP-1)，小鼠血糖和胰岛素敏感性也相应改善[41]。也有研究直接关注于M2型巨噬细胞，受体相互作用蛋白140(receptor interacting protein 140， RIP140)是一种NF-kB信号通路的协同刺激因子，能促进M1型巨噬细胞活化和炎症，基因敲除巨噬细胞RIP140能使肥胖小鼠脂肪组织M2型巨噬细胞比例增加约3倍，伴白色脂肪棕色化和胰岛素敏感性恢复，将该种小鼠模型的ATM(以M2型巨噬细胞为主)注入野生型肥胖小鼠脂肪组织，亦能诱导后者的米色脂肪生成，并减轻胰岛素抵抗[44]。M2型巨噬细胞对米色脂肪的诱导分化对治疗肥胖极具前景。
七、总结与展望
综上所述，营养过剩导致脂肪组织趋化因子分泌增加，募集骨髓来源的外周单核细胞进入脂肪组织并主要分化为M1型巨噬细胞，巨噬细胞原位增殖和迁出能力受损加重了ATM浸润。促炎的M1型巨噬细胞分泌大量炎性细胞因子，激活炎症通路，参与肥胖患者的胰岛素抵抗(图1)。脂肪组织的炎症也牵涉到其他固有免疫和适应性免疫细胞，本文不展开讨论。
充分了解肥胖中ATM的病理生理可为肥胖的免疫治疗提供有效的新靶点，有趣的是Asterholm等发现脂肪组织局部炎症信号通路缺陷的小鼠(TLR4信号通路缺陷、NF-κB信号通路缺陷或多种炎性信号通路同时缺陷)在予以高脂饮食负荷后，其血糖和胰岛素敏感性却比对照组更差。这似乎与之前炎症导致胰岛素抵抗的观点相悖，之前研究发现敲除肥胖小鼠的TNF-α能改善其胰岛素抵抗。可能的解释是局部炎症是肥胖情况下机体代偿的结果，它可能参与肥胖早期脂肪细胞的代偿性增殖和重塑，炎症信号通路缺陷导致多余的能量不能代偿性地储存于脂肪组织，过多的脂肪只能沉积于其他组织，加重脂肪肝和代谢异常。先前研究的TNF-α－/－HFD小鼠为全身系统性敲除TNF-α，而Asterholm实验中的模型仅为脂肪组织局部的炎症缺陷，这可能是两种研究结果相悖的原因。提示需要重新思考以ATM在胰岛素的抵抗的角色，肥胖时脂肪组织局部炎症和多系统炎症的关系也有待深入理解和探究。适度地调节免疫可能比单纯盲目地以抑制炎症能带来更多益处。
