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选择重组蛋白表达的合适方法

2019.3.28

重组蛋白是研究生物学过程的重要工具。需要使用表达系统来对其进行制备。合适表达系统的选择取决于重组蛋白的特性、重组蛋白的预期应用以及该系统能否生产足够量的蛋白质。
作者：伯吉斯等,主译：陈薇，本实验来自「蛋白质纯化指南」

实验步骤	一、引言选择合适醜组蛋白表达方法对于能否及时获取所需数量和质量的重z组蛋白非常关键。选择了错误的表达宿主可能导致蛋白质错误折叠或低量表达 . 缺少必要的翻译后修饰或不适当的修饰。选择表达系统时需騎虑的因素包括蛋白质的大小、二硫键的数目、所需翻译后修饰的类型及目标蛋自质的定位。纯化后的重组蛋自的期应用在决策过程中也是很关键的，其应用领域有四大类 : 结构研究、体外活性分析、作为抗原制备抗体和体内研究。本章的目的是为研究者选择合适的表达系统提供指导。然而，即便凭借这些指导原则，很多倩况下仍然无法预先确定哪种表达系统是最合适的，要想找到最理想的表达系统，必须对多种表达系统进行尝试。目前，学术界和工业界正在使用大量的表达系统。其中的一些表达系统非常新，并未经过足够的尝试以评价其实用性。而且，一些已经建立的重组蛋白表达系统 (如转基因动物），在技术上极具挑战性，需要消耗大量时间，并且极为昂贵, 因此对于一般实验室而言并不是可行的选择。就本章而言，我们只讨论大肠杆菌、毕赤酵母、杆状病毒/昆虫细胞及哺乳动物的表达系统(对这些表达系统更详细的介绍见第12〜1 5 章）。这 4 类表达系统都有简单易懂的操作方案，小量制备成本低廉，可以很容易从同行或科研产品公司（如Invitrogen、EMI>Novagen、 Stratagene和 P rom ega等）获得。下面将会对这几类表达系统的特点和可以进行的选择进行简要介绍, 在此重点关注它们之间的不同之处。最后我们会介绍一些策略以帮助研究者选择最合适的表达系统。二、大肠杆菌大肠杆菌是最早用于重组蛋白表达的宿主菌，其在蛋白质表达领域仍被认为是主要的工具。大肠杆菌较短的增殖时间使其成为一种简单快捷的重组蛋白表达系统。因此, 评估重组基因在大肠杆菌中的表达只需要不到1 周的时间。培养大肠杆菌的培养基价格低廉，而且已有简单直接的方法用于生产过程的放大(详见第 12章）。在大肠杆菌中，重组蛋白通常定位于胞质（cytoplasm) 中，也可以定位于周质(periplasm) ，在少数情况下会分泌到胞外。定位于胞质的蛋白质的表达效率是最高的，其产量通常可以占总生物质(biomass) 的 3〇% (Jana and D e b , 2〇〇5)。然而，重组蛋白过高的表达可能会导致不溶性蛋白聚集体的累积，从而形成包涵体Gndusi〇nS b〇dy)。不只是真核生物来源的蛋白质会形成包涵体，少数情况下，包括大肠杆菌在内的过表达原核生物来源的蛋白质也会形成包涵体。在大肠杆菌中，蛋白质翻译和折叠的速率比在真核细胞中几乎高1〇倍，这可能是真核蛋白质形成包涵体的原因（Andersson et al.，1982;Goustin and W ilt，1982)。在某些情况下，包涵体大大妨碍了获得可溶的活性蛋白质。不过，有时包涵体也能带来好处，其不易被蛋白酶降解，易于离心浓缩，很少被其他蛋白质污染，而且通过努力，也能将其再折叠成有活性的可溶性蛋白质(详见第 1 7 章）。 1.大肠杆菌：温度和分子伴侣已经有一些技术用于在胞质中尽可能多地形成可溶的正确折叠的蛋白质，而尽可能少地形成包涵体。最容易的方法是在蛋白质表达时降低温度至15〜30°C (Sahdevetal. ，2008)。据推测，降低温度会降低蛋白质转录、翻译和折叠的速率，从而使蛋白质能够正确折叠（V e r a e ta L , 2006)。此外，研究显示，低温还会降低热休克蛋白酶（heatshock protease)的活性 (Spiess e ta L , 1999)。一些研究者通过在胞质中与重组蛋白共表达分子伴侣(molecular chaperone)来促进蛋白质的可溶性 (Young etal. , 2004)。该方法的运用似乎具有蛋白质特异性，因此需要针对每种目标重组蛋白分别进行实验(Baneyx and Mujacic，2004)。 2. 大肠杆菌：融合标签在重组蛋白的 N 端或 C 端融合可溶性的融合标签(fusion tag)是提高许多重组蛋白可溶性的另一种方法(Esposito and Chatterjee, 2006)。已经证明能够提高重组蛋白可溶性的融合标签包括谷胱甘肽S转移酶如glutathione-S-transferase,GST)、硫氧还蛋白（thioredoxin)、麦芽糖结合蛋白（maltose-binding protein，M B P )、小分子泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-modifier,S U M O )及 N u s A 标签（JV-utilization substrate)。其中 G S T 标签和 M B P 标签还有另外的好处, 可以用做亲和纯化的标签。然而令人遗憾的是没有哪一种标签能够适用于所有的重组蛋白，必须对多种融合标签的促可溶表达能力进行评估。有多种策略可用于移除重组蛋白的融合标签，广泛的做法是在融合标签和重组蛋白之间插入蛋白酶酶切位点，然后使用特异性的蛋白酶将其切除。有时候，移除标签后重组蛋白可能会变得不可溶，所以必须对这一方法进行谨慎的测试。 3.大肠杆菌：二硫键的形成对于胞质表达，大肠杆菌通常不能促使重组蛋白二硫键(disulfide bond)的正确形成；由于二硫键氧化还原酶系统(Dsb system)催化作用的存在, 周质通常是大肠杆菌中唯一可形成二硫键的场所(Andersen e t a l.， 1997; Bardwell, 1994) 。因此，如果重组蛋白需要形成二硫键，就需要利用一个可切割的信号肽（如 pelB)将其定位于周质。然而，周质表达的一个主要不利之处在于蛋白质的表达量会大大降低。硫氧还蛋白（thioredoxin) 和谷氧还蛋白（glutaredoxin) 能够促进胞质内半腕氣酸的还原反应，通过对大肠杆菌基因组的改造以破坏D sb系统的硫氧还蛋白还原酶基因（thioredoxin reductase gene「 trrB )和谷胱甘肽还原酶基（glutathione reductase gene,g o r), 就可以在胞质内创造更加适于二硫键形成的环境(Bessette e ta l.，1999)。这些基因工程改造的菌株已由EMI>Novagen(Origami)公司实现了商业化。如果需要形成更多的二硫键，可以将重组蛋白与硫氧还蛋白融合后在trxB-/gor””大肠杆菌菌株中进行表(LaVallie et aL ， 1993) 。 4. 大肠杆菌：翻译后修饰最后，必须认识到相比于真核生物，大肠杆菌对蛋白质进行翻译后修饰 (posttranslational modification) 的能力有限。例如，大肠杆菌不支持酶介导的 N -连接的糖基化 (iVlinked glycosylation)、0 连接的糖基化（O l i n k e d glycosylation) 、酰胺化（amidation) 、轻基化 (hydroxylation) 、豆蘧醜化（myristoylation) 、棕榈酰化 (palmitoylation) 和硫酸化(sulfation) 三、毕赤酵母酵母作为另一种表达重组蛋白的强有力的传统工具，已被成功应用于大量蛋白质的表达。酵母既具有大肠杆菌的许多优点，如增殖时间短、基因组易于操作，又具有真核生物的优势，包括改善的蛋白质折叠的能力和大部分的翻译后修饰能力。第一个常规应用于重组蛋白表达的酵母菌株是酿酒酵母（SaccAarow^yces ceretw』 siae) (Strausberg andStrausberg, 2001)。然而，近 1 5 年来，毕赤酵母 (Pz’ c/iia和u ‘ f o r k ) 已经成为酵母的首选 , 因为该菌株重组蛋白的表达水平高于酿酒酵母 (详见第 1 3 章）。毕赤酵母是甲醇营养型酵母 (methyltropic yeast), 可利用甲醇作为其唯一的碳源（Cregg et al. , 1985)。毕赤酵母在含甲醇的培养基中生长，会导致其醇氧化酶 (alcohol oxidase，A 0 X )和二羟丙酮合酶 (dihydroxyacetone synthase)基因发生强烈的诱导转录（C r e g g ，2007)。经过诱导，这些蛋白质可以占到毕赤酵母总生物质的 3 0 % 。研究人员将醇氧化酶 I (A O X l ) 的严密调控的强启动子整合入大部分重组蛋白表达质粒用来驱动重组蛋白的表达，已经实现了对该甲醇依赖基因诱导作用的利用（Daly and H e a m , 2005)。毕赤酵母的表达载体会整合到基因组中，而酿酒酵母的表达载体是游离复制 (replicating episomally)的质粒型表达载体，这种载体很不稳定。利用毕赤酵母评估重组基因的表达需要 3〜 4 周，这包括酵母的转化、筛选阳性整合的转化子和蛋白质的表达所需的时间。毕赤酵母一个能打动人的优点是其在合适的培养条件下能够获得极高的细胞密度 (C r e g g , 2007)。只需使用成本低廉的培养基，毕赤酵母就能达到 120 g /L 的细胞干重密度。需要重点注意的一点是，诱导用培养基中需要含有低百分比的甲醇，在大规模培养中，甲醇的量达到了产生火灾风险的程度，需要采取更高一级的安全措施。毕赤酵母已经用于获取胞内和分泌表达的蛋白质。与其他真核生物一样 , 它可以有效地形成二硫键，而且已经成功用于表达含有多个二硫键的蛋白质。为了便于分泌表达 ,必须对重组蛋白进行改造以使其携带信号肽序列。最常用的信号肽是酿酒酵母的 cr交配因子 (a-mating factor)的前-原(pre-pro)序列（Daly and H e a r n , 2005)。由于毕赤酵母只分泌很少的内源性蛋白，从培养基中纯化重组蛋白是个相对简单的工作。如果重组蛋白的酶解比较严重，可以利用 Pep4 蛋白酶缺陷型毕赤酵母菌株进行表达 (Gleeson et al. ，1998)。该菌株具有较低的液泡肽酶 A (vaCU〇 k peptidase A )活性，该酶负责活化羧肽酶Y(carboxypeptidase Y )和蛋白酶 B K p r o t e a s e B I ) 。酵母具有翻译后在特异的天冬酰胺残基(N-连接)和丝氨酸/苏氨酸残基(〇■连接)添加聚糖 (glycan)的能力。这些聚糖的结构与昆虫和哺乳动物细胞修饰添加的聚糖的结构是很不相同的。在毕赤酵母中，N-连接的聚糖是高甘露糖(mannose)型的，通常有 8〜17个甘露糖，而酿酒酵母聚糖含有50〜150个甘露糖残基(Celik et al. ， 2007; Gemmill andTrimble, 1999)。与昆虫和哺乳动物细胞相似的是，在酵母中 N-连接聚糖的一致序列是Asn-Xaa-Ser/Thr。有两个研究小组已经通过全面的工程改造获得了两个毕赤酵母的菌株，它们能够产生可以与哺乳动物细胞中相媲美的复杂的 N-连接聚糖结构（Hamiltonand Gerngross, 2〇 07)。然而, 其他研究人员只能使用Roland Contreras研究小组开发的菌株，而且必须得到Research Corporation Technologies的许可。对毕赤酵母中O■连接聚糖的结构研究还不很充分，但已知其是通过在丝氨酸/苏氨酸残基上添加1〜4 个甘露糖残基形成的（Goto, 2007; Trimble et al.， 20 〇 4)。已有数个报道指出，某些特定蛋白质在毕赤酵母中表达时会被添加O 连接聚糖，而在哺乳动物细胞中的内源性表达却不会这样（Daly and Hearn， 2005)。四、杆状病毒/昆虫细胞在昆虫细胞中由杆状病毒(baculovirus)介导的蛋白质表达为重组蛋白制备提供了另外一种手段(详见第 14章）。杆状病毒是一种裂解性的（lytic) 、大的（130 k b )双链 D N A病毒，其中桃木菌属(Awi呀病毒是最常用于重组蛋白表达的杆状病毒。杆状病毒通常在来源于秋天彳了军虫草地贪夜蛾（fall a r m y w o r m Spodoptera frugiperda )(Sf 9 、Sf 2 1 ) 的昆虫细胞系中进行增殖, 而重组蛋白的表达既可在上述细胞系中完成，也可在来源于拟尺罐粉纹夜蛾（cabbage looper Tii) 的细胞（H i g hFive)中进行(Kost etal. ， 2〇〇5)。起初，构建重组杆状病毒的工作涉及将具有杆状病毒 D N A 侧翼序列的目标基因与杆状病毒的D N A 共转染昆虫细胞(insect cell) , 然后筛选出稀有的同源重组体。重组体的鉴定是通过筛选形态改变的空斑(plaque)来实现的，而且通常需要另外的多轮空斑筛选以确保制备的重组病毒中未污染有野生型病毒。这种耗时耗力的重组病毒制备方法在大多数时候已经被位点特异性转座技术(Bac^to-Bac或 Ba c uIoDirect, Invitrogen) 和改良的同源重组技术 (该技术使用在 orfi62 9 含有一个致死突变的工程杆状病毒）（来自 Oxford Expression Technologies 的 flashBAC, 或来自 E M D ——N o -v a g e n 的 B a c M a g i c ) 所取代。因为其重组效率为 100%, 这两种方法都省略了分离空斑的操作。1 轮或 2 轮的重组病毒扩增后，研究人员可以使用空斑分析法、更新颖更快速的实时定量 PC R法或基于抗体的分析法对杆状病毒的浓缩液进行定量（Hitchm a n et al. ，2007; K w o n et a l .， 2〇 02)。重组杆状病毒构建和定量方法上的进步已经极大地减少了使用杆状病毒进行表达的时间—- 缩短至大约3 周，这其中包含为了优化表达而耗费的时间。杆状病毒表达系统中最常用的是polH 启动子和 plO启动子，二者均能在杆状病毒感染的晚期经诱导产生高水平的表(Ikonomou e t a l . ， 2003)。在此阶段, 细胞开始死亡，并伴随着蛋白酶的释放，这些蛋白酶可能会导致重组蛋白降解。为了减少重组蛋白的酶解，已经使用了在细胞裂解周期中较早阶段激活的启动子，如基本启动子（basic prom oter) (Ikonomou et al. ， 2003) 。 CA£A 和1)——〇1执基因分别编码几丁质酶（chitinase) 及一种组织蛋白酶(cathepsin protease)，也可以通过构建二者的基因缺陷型以尽量降低蛋白质水解的作用（Monsma and Scott, 1997)。杆状病毒介导的蛋白质表达通常既能用于制备胞质表达的重组蛋白，又能用于获取分泌表达的重组蛋白。高效的分泌表达一般需要信号肽的参与。昆虫和哺乳动物的信号序列都能引导重组蛋白进入昆虫细胞的分泌途径。起初，昆虫细胞的培养是在含血清的培养基中进行，这使分泌蛋白的纯化变得复杂。近来新研发的培养基允许使用动物组织或植物组织的蛋白质水解液代替血清，从而大大简化了蛋白质的纯化 (Ikonomou et al. ，2003)。不过，这种特殊的培养基造价高昂，限制了它在大规模生产中的应用。昆虫细胞能有效地在重组蛋白中形成二硫键，也能进行绝大部分发现于哺乳动物细胞的翻译后修饰。然而，大部分昆虫细胞中形成的JV-连接聚糖都是岩藻糖苷寡甘露糖(fucosylatedpaucimannose)结构（Man3 GlcNAc2-N-A sn) (H arrison and Jarvis, 200 6;Jenkins e ta l. ，1 9 % ) 。这一发现促使人们于最近构建了能够产生含有常见于哺乳动物细胞中的复杂N -连接聚糖的糖蛋白的昆虫细胞系（Harrison and Jarvis, 2006)。一个能够表达数种糖基转移酶的转基因 S f-9 昆虫细胞系已实现了商业化（Mimiccelllin eInvitrogen), 其产生的 N -连接聚糖包含一个双触须样唾液酸化(sialylated)结构。目前仅有几篇文献描述了昆虫细胞产生的O 连接聚糖的结构(Chen et a l . ， 1991; Sugyiama eta l . ， 1993; Thomsen et a l . ， 2004)。五、哺乳动物细胞以前通常认为哺乳动物表达方法是重组蛋白表达效率最低的方法。然而，最近的研究进展已经极大地提高了哺乳动物细胞系的表达水平(详见第 15章)。例如, 有报道称利用稳定转染的中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,C H O )细胞，重组抗体的表达水平可以达到几个毫克每升(Figueroa e t a l . ， 2007; W urm, 2004)。虽然目前已经测试了多种细胞系和表达策略，但本章我们主要关注人胚肾（human embryonic kidney,H E K 293)细胞的瞬时转染和C H O 细胞的稳定转染。 H E K 293 细胞系来源于腺病毒转化的人胚胎肾细胞。利用特定的转染试剂，如阳离子脂质体（cationic lipids) 、憐酸耗（calcium ph o sp h ate)或聚乙烯亚胺（polyethyleneim in e)，H E K 2 93细胞能够实现较高的瞬时转染效率（> 8 0 % )(D u ro ch er et aL , 2002;Jo rd an etaL , 1996)。对于大规模的瞬时转染( > i 〇 0 mL)，相比阳离子脂质体，以磷酸钙或聚乙嫌亚胺作为转染试剂是更加经济高效的选择 (Baldi et a L ， 2007)。已经有人进行了生物反应器级别的瞬时转染，不过对于大多数实验室来说, 这个规模在技术上还是很有挑战性的 (G irard etal. , 2002)。瞬时转染技术相对简单，而且对于给定的重组蛋白，其评估可在 2 周内完成。当需要大量的重组蛋白时，通常选择 C H O 细胞作为哺乳动物表达系统。例如，当前市场上大部分治疗用抗体就是用该细胞系生产的。标准的稳定转染 C H O 细胞表达技术涉及使用具有二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase,D H FR) 选择标记表达框和目标基因表达框的载体转染 D H F R 缺陷型的 CH◦ 细胞（W urm ，2004)。二氢叶酸还原酶能将二氢叶酸（dihydrofolate) 还原为四氢叶酸（tetrahydrofolate)，后者对于嘌呤（purine)、特定的氨基酸和脱氧胸苷酸 (thymidylic acid)的从头合成是必需的。氨甲蝶呤 (methotrexate)能结合并抑制 D H FR，可作为选择试剂使用，只有整合了 DHFR 选择标记表达框的细胞才能存活。连续提高氨甲蝶呤的浓度能造成 D H F R 基因及与其相连的目的基因的大量扩增。经过至少一轮的氨甲蝶呤筛选后, 利用有限稀释法将稳定转染的细胞克隆到多孔板中，就实现了稳定转染细胞群的亚克隆。通常的情况是，筛选得到的亚克隆中只有小部分能够以较高的水平表达重组基因，因为大部分克隆中表达框都整合到了转录不活跃的异染色质区域。不幸的是，整个选择和筛选的过程需要至少 2〜3 个月，这是 CHO表达方法最主要的缺点。不过，目前基于流式技术和自动化技术的高通量技术已经大大简化了高表达克隆的快速筛选和选择 (Browne and Al-Rubeai，2007)。另外一个进展是利用位于重组基因表达框两侧的特异性顺式作用 D N A 元件 (e x a c tin g DNA element),它们可以使整合位点的转录变得活跃 (Kwaks and O tte，2006)。不幸的是，大部分此类D N A 元件由公司拥有，实验室使用时必须得到公司的许可。此外，即使有了上述的进展，获得高表达 C H O 克隆株需要的时间依然没有太大的变化。哺乳动物表达系统主要用于制备分泌的重组蛋白，而不是制备胞内表达的蛋白质。已经开发出了针对 C H O 和 HEK293细胞系的无血清培养基, 这使分泌表达的重组蛋白的纯化变得简单。不过, 这种培养基价格不菲，使得大规模的生产非常昂贵。相较于其他表达系统的宿主，哺乳动物细胞具有最出色的蛋白质折叠和二硫键形成能力。哺乳动物细胞生成的N-连接聚糖和 0-连接聚糖的结构变化很大，这不仅取决于蛋白质，也与作为表达宿主的哺乳动物细胞的类型相关（Jenkins et al., 1996)。此外，细胞的培养条件，如营养成分、p H 、温度、氧气的水平以及氨浓度都能够对糖基化产生显著的影响 (Butler，2006)。 JV-连接糖基化的糖会是寡聚甘露糖(〇 lig 〇 mannose)、杂合聚糖及别的复杂聚糖结构，但所有的结构都会包含— 个 Man3 GlcNac2 核心（Bhatia and Mukhopadhyay，1998)。寡甘露糖聚糖有 2〜6 个附加的甘露糖残基，这些残基可被磷酸化或硫酸化。最常见的复杂聚糖结构具有 2〜4 个连接于甘露糖的 Gal ，4-GlcNac2 基团，它能够形成 2 个、3 个和 4 个触须样的分支结构。分支结构末端为唾液酸，分支上还可连接岩藻糖。杂合聚糖同时具有寡聚甘露糖和复杂聚糖结构的特征^ 可根据其核心结构将O 连接糖基化结构分为 8 类 : 0 乙醜半乳糖胺型糖基化(〇 GalN Ac-type glycosylation)、O-乙酰氨基葡糖型糖基化（O G lcN A otype glycosylation)、O-岩藻糖基化（Ofucosylation)、O-甘•糖基化（Om annosyiation)、O-葡糖基化（O glucosylation)、憐酸糖基化(phosphoglycosylation)、O-葡糖胺聚糖型糖基化（〇 ——glyc 〇 saminoglycan-type glycosyiation)和胶原型糖基化（collagen-type glycosylation) (Peter-Katalinic，2005)。六、蛋白质的特性在选择表达系统时, 可以很容易地通过文献调研来确认重组蛋白之前是否已被表达过并对公开出版的表达策略做出评估。借鉴文献报道时，考虑清楚文献中重组蛋白的应用目的与你的预期应用是否相似或相容是很重要的。缺少文献信息时，表达或详细介绍同源蛋白的报道也是很有用的。在过去的十年，表达的蛋白质的数目有了戏剧性地增加，这在一定程度上归功于多种基因组序列的测定、高通量表达方法的发展以及大规模的蛋白质结构计划（protein structure initiative,P S I )。这种趋势很可能会持续下去，这意味着最终前人的大量数据可以使表达系统的选择变得更加简单容易。 1. 蛋白质的特性：大肠杆菌与密码子用法 —般来说，在重组蛋白表达宿主的选择中，对原核来源的蛋白质应当只选择大肠杆菌进行表达，而不是真核表达系统, 因为通常真核生物的翻译后修饰能力和改善的折叠能力对原核蛋白来说是不必要的，甚至是不想要的。对于真核蛋白来说情况就不同了，因为有大量的实例表明，真核蛋白能在大肠杆菌中进行成功地表达（Sahdev et al. ， 2008)。当使用原核系统表达真核蛋白时，一个非常重要的考虑是: 像所有生物一样，大肠杆菌对密码子的使用有偏性，其 t R N A 丰度反映了这一•偏性（Gustafsson et al. ， 2004; M a r i n ，2008)。表达含有数个大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白时会受对应的 t R N A 丰度的限制而效率不高。 tR N A 短缺会导致翻译移框、氨基酸错误掺入及翻译提前终止等。这个问题在稀有密码子集中分布于 N 端时尤其明显（K a n e , 1995)。不过, 通过合成密码子优化的基因或者使用稀有密码子 t R N A 丰度增加的商业化工程菌株（如 R osetta 菌株，E M D ——N o v a g e n ) 可以避免这个问题。在多数情况下, 如果重组基因是在亲缘关系很远的生物宿主中表达, 密码子偏性也需要加以矫正。 2. 蛋白质的特性: 胞质蛋白对于胞质蛋白来说，选择最佳的表达系统取决于蛋白质的大小和分子内二硫键的数目。对于分子质量为10〜50 kD a 并含有极少二硫键的蛋白质而言，大肠杆菌是实现蛋白质可溶性表达的很好选择（D y s o n e ta L ， 2004)。对于更大或具有许多二硫键的蛋白质来说，如果需要可溶性表达，那么通常应优先选择杆状病毒或酵母表达系统。对于10 k D a 以下，有极少甚至没有二硫键的蛋白质，已通过融合可溶性标签，在大肠杆菌中实现了成功表达（Esposito and Chatterjee, 2006)。或者, 也可以将这些小蛋白质在毕赤酵母中进行分泌表达(Daly and H earn, 2005)。然而，在这一途径中, 必须小心监测，因为正常情况下存在于胞内的蛋白质被强制进入分泌途径时可能出现无意产生的糖基化。这可以通过检查序列确认其不含一致的N-连接糖基化位点来实现。遗憾的是，对于〇-连接糖基化，没有保守序列，所以必须对分泌的重组蛋白进行分析以确保其不含〇-连接聚糖。 3. 蛋白质的特性：分泌蛋白所有的表达宿主都可用于生产分泌蛋白。不过，正如之前所述，大肠杆菌缺少大部分发现于真核生物中的翻译后修饰功能。因此，大肠杆菌可能不适于表达分泌的真核蛋白，不过这也在很大程度上取决于下游的应用。 4. 蛋白质的特性: 膜蛋白对于蛋白质的大量表达来说，膜蛋白极具挑战性。在某些情况下，只表达可溶的、亲水的部分就足够了，此时可以移除跨膜结构域，表达可溶部分。对于完整膜蛋白的表达，如何选择最佳的表达系统还没有明确的指导原则 (Sarramegna et al. ，2003)。不过，对于大部分真核膜蛋白，由于在折叠和翻译后修饰能力上的限制，大肠杆菌表达系统通常不是一个很好的选择。相对的，研究者已报道利用杆状病毒和酵母表达系统在一定程度上成功地实现了 G 蛋白偶联受体的表达。 5. 蛋白质的特性: 毒性蛋白对表达宿主有毒的重组蛋白会给表达带来挑战, 不过这通常是可以克服的。如果重组蛋白有毒性，确定其毒性是否具有宿主细胞特异性通常是有用的。如果是的话，那么可以选择在一个相容性更好的表达宿主中进行表达。另一个选择是使用严格调控的、可诱导的表达系统，如在大肠杆菌和毕赤酵母中应用的那些表达系统。例如，已经开发了数个精确调控的可诱导大肠杆菌表达系统(Saida, 2007)。在这些系统中，重组基因的表达由可诱导启动子、转录终止子、质粒拷贝数的控制或重组基因编码序列的修饰来调控。在可用的毕赤酵母系统中，A O X l 启动子受诱导机制以及阻遏/去阻遏方法的联合严格调控(Daly and H eam , 2005)。另外，有数项研究表明杆状病毒/昆虫表达系统可用于表达毒性蛋白（Aguiar et al., 2:006; Korth and Levings，1993)。最后，对于哺乳动物表达系统来说，最简单的选择是瞬转表达。 C H O 细胞中的数种可诱导表达系统都需要花费相当多的时间以完成必要的细胞工程改造，而且利用这些表达系统很难获得严格调控的基因表达，而这种严格调控对于防止细胞死亡来说是必需的 (Rossi and Blau, 1998)。七.重组蛋白的应用用于结构研究时，重组蛋白的表达要求正确的蛋白质折叠、形成正确的二硫键、均一的重组产物。前面已经介绍了每种表达系统的蛋白质折叠和二硫键形成的内在能力。不均一性的潜在来源包括鱗酸化、甲硫氣酸氣肤酶(methionineaminopeptidase) 对起始甲硫氨酸的低效切割以及糖基化。不幸的是, 不均一的磷酸化常见于重组蛋白激酶的表达,并且每一种表达宿主都有类似报道。在这种情况下, 可以通过磷酸酶处理去除重组蛋白上的磷酸基团以获得均一性。当重组蛋白在胞内表达时，可能会出现 N 端甲硫氨酸的不均一性。原核生物和真核生物都含有甲硫氨酸氨肽酶，甲硫氨酸的切割效率受起始甲硫氨酸相邻的氨基酸的影响 (Giglione etal., 2004)。通常，该相邻氨基酸侧链的大小与甲硫氨酸切割的效率负相关。然而，在大肠杆菌中，高水平表达的重组蛋白会使酶达到饱和，并改变有效切割的相关规则 (Dong etal.，1996)。这种不均一性可以通过小心选择起始甲硫氨酸的相邻氨基酸或利用 N 端的可切割的标签来避免。糖基化的不均一性可见于糖蛋白在所有真核生物中的表达。不过在昆虫或酵母宿主中这种不均一性通常会低一些 (Jenkins etal. ，1996)。无论采用何种表达宿主, 通常会在试图对重组蛋白进行结晶前除去糖基团。正常情况下，若制备的重组蛋白用做免疫用抗原时，任何表达宿主都是可用的。对于糖蛋白来说，有时还不清楚聚糖的存在是否会改变重组抗原的免疫原性（Bhatia andMukhopadhyay, 1998； Prasad et al., 1995) 适用于体外活性研究及体内实验的重组蛋白的制备要求蛋白质正确折叠和二硫键正确形成。对于糖蛋白来说，N -连接聚糖的存在以及聚糖基团的结构对这两类应用都有重要的影响，因此在选择真核表达宿主时必须加以考虑。研究表明，JV-连接聚糖对蛋白质的结构有积极的影响并增加了蛋白质的稳定性 (Bhatia and M u k h o p a d h y a y , 1998)。在体外，已有研究显示, 某些蛋白质配基上的N -连接聚糖的结构会影响其与受体结合的亲和力及信号转导。在重组免疫球蛋白中，F c 区保守的 N -连接聚糖影响了其在体外的效应活性(Presta, 2008)。例如，人 I g G l 的 N -连接聚糖中岩藻糖的存在降低了抗体依赖的细胞毒性活性(Shinkawa etal.， 2003)。在体内，蛋白质上 N -连接聚糖结构极大地影响了其代谢清除和生物分布。例如，无唾液酸帽的 N -连接聚糖会被肝受体 (hepatic receptor),清除这类受体包括脱唾液酸糖蛋白(asialoglycoprotein) 受体和甘露糖受体（Weigeland Yik， 2002)。 O-连接糖基化的重要性还不明确。如果重组蛋白的糖基化修饰作用还不清楚，那么比较安全的策略是选择与重组基因来源宿主相似的表达宿主。八.结论大肠杆菌、毕赤酵母、杆状病毒/昆虫细胞及哺乳动物表达系统在表达重组蛋白方面各有其优缺点 (表 11.1)。一个给定的表达系统能否高水平表达蛋白质并获得高质量的产品, 这在很大程度上取决于该蛋白质。在选择表达方法时，必须认真地评估重组蛋白的特性及下游的应用。不幸的是，有时候表达方法的选择并不是显而易见的，此时必须对数种表达宿主进行评估。展开

实验步骤

一、引言

选择合适醜组蛋白表达方法对于能否及时获取所需数量和质量的重z组蛋白非常关键。选择了错误的表达宿主可能导致蛋白质错误折叠或低量表达 . 缺少必要的翻译后修饰或不适当的修饰。选择表达系统时需騎虑的因素包括蛋白质的大小、二硫键的数目、所需翻译后修饰的类型及目标蛋自质的定位。纯化后的重组蛋自的期应用在决策过程中也是很关键的，其应用领域有四大类 : 结构研究、体外活性分析、作为抗原制备抗体和体内研究。本章的目的是为研究者选择合适的表达系统提供指导。然而，即便凭借这些指导原则，很多倩况下仍然无法预先确定哪种表达系统是最合适的，要想找到最理想的表达系统，必须对多种表达系统进行尝试。

目前，学术界和工业界正在使用大量的表达系统。其中的一些表达系统非常新，并未经过足够的尝试以评价其实用性。而且，一些已经建立的重组蛋白表达系统 (如转基因动物），在技术上极具挑战性，需要消耗大量时间，并且极为昂贵, 因此对于一般实验室而言并不是可行的选择。就本章而言，我们只讨论大肠杆菌、毕赤酵母、杆状病毒/昆虫细胞及哺乳动物的表达系统(对这些表达系统更详细的介绍见第12〜1 5 章）。这 4 类表达系统都有简单易懂的操作方案，小量制备成本低廉，可以很容易从同行或科研产品公司（如Invitrogen、EMI>Novagen、 Stratagene和 P rom ega等）获得。下面将会对这几类表达系统的特点和可以进行的选择进行简要介绍, 在此重点关注它们之间的不同之处。最后我们会介绍一些策略以帮助研究者选择最合适的表达系统。

二、大肠杆菌

大肠杆菌是最早用于重组蛋白表达的宿主菌，其在蛋白质表达领域仍被认为是主要的工具。大肠杆菌较短的增殖时间使其成为一种简单快捷的重组蛋白表达系统。因此, 评估重组基因在大肠杆菌中的表达只需要不到1 周的时间。培养大肠杆菌的培养基价格低廉，而且已有简单直接的方法用于生产过程的放大(详见第 12章）。

在大肠杆菌中，重组蛋白通常定位于胞质（cytoplasm) 中，也可以定位于周质(periplasm) ，在少数情况下会分泌到胞外。定位于胞质的蛋白质的表达效率是最高的，其产量通常可以占总生物质(biomass) 的 3〇% (Jana and D e b , 2〇〇5)。然而，重组蛋白过高的表达可能会导致不溶性蛋白聚集体的累积，从而形成包涵体Gndusi〇nS b〇dy)。不只是真核生物来源的蛋白质会形成包涵体，少数情况下，包括大肠杆菌在内的过表达原核生物来源的蛋白质也会形成包涵体。在大肠杆菌中，蛋白质翻译和折叠的速率比在真核细胞中几乎高1〇倍，这可能是真核蛋白质形成包涵体的原因（Andersson et al.，1982;Goustin and W ilt，1982)。在某些情况下，包涵体大大妨碍了获得可溶的活性蛋白质。

不过，有时包涵体也能带来好处，其不易被蛋白酶降解，易于离心浓缩，很少被其他蛋白质污染，而且通过努力，也能将其再折叠成有活性的可溶性蛋白质(详见第 1 7 章）。

1.大肠杆菌：温度和分子伴侣

已经有一些技术用于在胞质中尽可能多地形成可溶的正确折叠的蛋白质，而尽可能少地形成包涵体。最容易的方法是在蛋白质表达时降低温度至15〜30°C (Sahdevetal. ，2008)。据推测，降低温度会降低蛋白质转录、翻译和折叠的速率，从而使蛋白质能够正确折叠（V e r a e ta L , 2006)。此外，研究显示，低温还会降低热休克蛋白酶（heatshock protease)的活性 (Spiess e ta L , 1999)。一些研究者通过在胞质中与重组蛋白共表达分子伴侣(molecular chaperone)来促进蛋白质的可溶性 (Young etal. , 2004)。该方法的运用似乎具有蛋白质特异性，因此需要针对每种目标重组蛋白分别进行实验(Baneyx and Mujacic，2004)。

2. 大肠杆菌：融合标签

在重组蛋白的 N 端或 C 端融合可溶性的融合标签(fusion tag)是提高许多重组蛋白可溶性的另一种方法(Esposito and Chatterjee, 2006)。已经证明能够提高重组蛋白可溶性的融合标签包括谷胱甘肽S转移酶如glutathione-S-transferase,GST)、硫氧还蛋白（thioredoxin)、麦芽糖结合蛋白（maltose-binding protein，M B P )、小分子泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-modifier,S U M O )及 N u s A 标签（JV-utilization substrate)。其中 G S T 标签和 M B P 标签还有另外的好处, 可以用做亲和纯化的标签。然而令人遗憾的是没有哪一种标签能够适用于所有的重组蛋白，必须对多种融合标签的促可溶表达能力进行评估。有多种策略可用于移除重组蛋白的融合标签，广泛的做法是在融合标签和重组蛋白之间插入蛋白酶酶切位点，然后使用特异性的蛋白酶将其切除。有时候，移除标签后重组蛋白可能会变得不可溶，所以必须对这一方法进行谨慎的测试。

3.大肠杆菌：二硫键的形成

对于胞质表达，大肠杆菌通常不能促使重组蛋白二硫键(disulfide bond)的正确形成；由于二硫键氧化还原酶系统(Dsb system)催化作用的存在, 周质通常是大肠杆菌中唯一可形成二硫键的场所(Andersen e t a l.， 1997; Bardwell, 1994) 。因此，如果重组蛋白需要形成二硫键，就需要利用一个可切割的信号肽（如 pelB)将其定位于周质。然而，周质表达的一个主要不利之处在于蛋白质的表达量会大大降低。硫氧还蛋白（thioredoxin) 和谷氧还蛋白（glutaredoxin) 能够促进胞质内半腕氣酸的还原反应，通过对大肠杆菌基因组的改造以破坏D sb系统的硫氧还蛋白还原酶基因（thioredoxin reductase gene「 trrB )和谷胱甘肽还原酶基（glutathione reductase gene,g o r), 就可以在胞质内创造更加适于二硫键形成的环境(Bessette e ta l.，1999)。这些基因工程改造的菌株已由EMI>Novagen(Origami)公司实现了商业化。如果需要形成更多的二硫键，可以将重组蛋白与硫氧还蛋白融合后在trxB-/gor””大肠杆菌菌株中进行表(LaVallie et aL ， 1993) 。

4. 大肠杆菌：翻译后修饰

最后，必须认识到相比于真核生物，大肠杆菌对蛋白质进行翻译后修饰 (posttranslational modification) 的能力有限。例如，大肠杆菌不支持酶介导的 N -连接的糖基化 (iVlinked glycosylation)、0 连接的糖基化（O l i n k e d glycosylation) 、酰胺化（amidation) 、轻基化 (hydroxylation) 、豆蘧醜化（myristoylation) 、棕榈酰化 (palmitoylation) 和硫酸化(sulfation)

三、毕赤酵母

酵母作为另一种表达重组蛋白的强有力的传统工具，已被成功应用于大量蛋白质的表达。酵母既具有大肠杆菌的许多优点，如增殖时间短、基因组易于操作，又具有真核生物的优势，包括改善的蛋白质折叠的能力和大部分的翻译后修饰能力。第一个常规应用于重组蛋白表达的酵母菌株是酿酒酵母（SaccAarow^yces ceretw』 siae) (Strausberg andStrausberg, 2001)。然而，近 1 5 年来，毕赤酵母 (Pz’ c/iia和u ‘ f o r k ) 已经成为酵母的首选 , 因为该菌株重组蛋白的表达水平高于酿酒酵母 (详见第 1 3 章）。毕赤酵母是甲醇营养型酵母 (methyltropic yeast), 可利用甲醇作为其唯一的碳源（Cregg et al. , 1985)。毕赤酵母在含甲醇的培养基中生长，会导致其醇氧化酶 (alcohol oxidase，A 0 X )和二羟丙酮合酶 (dihydroxyacetone synthase)基因发生强烈的诱导转录（C r e g g ，2007)。经过诱导，这些蛋白质可以占到毕赤酵母总生物质的 3 0 % 。研究人员将醇氧化酶 I (A O X l ) 的严密调控的强启动子整合入大部分重组蛋白表达质粒用来驱动重组蛋白的表达，已经实现了对该甲醇依赖基因诱导作用的利用（Daly and H e a m , 2005)。毕赤酵母的表达载体会整合到基因组中，而酿酒酵母的表达载体是游离复制 (replicating episomally)的质粒型表达载体，这种载体很不稳定。利用毕赤酵母评估重组基因的表达需要 3〜 4 周，这包括酵母的转化、筛选阳性整合的转化子和蛋白质的表达所需的时间。毕赤酵母一个能打动人的优点是其在合适的培养条件下能够获得极高的细胞密度 (C r e g g , 2007)。只需使用成本低廉的培养基，毕赤酵母就能达到 120 g /L 的细胞干重密度。需要重点注意的一点是，诱导用培养基中需要含有低百分比的甲醇，在大规模培养中，甲醇的量达到了产生火灾风险的程度，需要采取更高一级的安全措施。

毕赤酵母已经用于获取胞内和分泌表达的蛋白质。与其他真核生物一样 , 它可以有效地形成二硫键，而且已经成功用于表达含有多个二硫键的蛋白质。为了便于分泌表达 ,必须对重组蛋白进行改造以使其携带信号肽序列。最常用的信号肽是酿酒酵母的 cr交配因子 (a-mating factor)的前-原(pre-pro)序列（Daly and H e a r n , 2005)。由于毕赤酵母只分泌很少的内源性蛋白，从培养基中纯化重组蛋白是个相对简单的工作。如果重组蛋白的酶解比较严重，可以利用 Pep4 蛋白酶缺陷型毕赤酵母菌株进行表达 (Gleeson et al. ，1998)。该菌株具有较低的液泡肽酶 A (vaCU〇 k peptidase A )活性，该酶负责活化羧肽酶Y(carboxypeptidase Y )和蛋白酶 B K p r o t e a s e B I ) 。

酵母具有翻译后在特异的天冬酰胺残基(N-连接)和丝氨酸/苏氨酸残基(〇■连接)添加聚糖 (glycan)的能力。这些聚糖的结构与昆虫和哺乳动物细胞修饰添加的聚糖的结构是很不相同的。在毕赤酵母中，N-连接的聚糖是高甘露糖(mannose)型的，通常有 8〜17个甘露糖，而酿酒酵母聚糖含有50〜150个甘露糖残基(Celik et al. ， 2007; Gemmill andTrimble, 1999)。与昆虫和哺乳动物细胞相似的是，在酵母中 N-连接聚糖的一致序列是Asn-Xaa-Ser/Thr。有两个研究小组已经通过全面的工程改造获得了两个毕赤酵母的菌株，它们能够产生可以与哺乳动物细胞中相媲美的复杂的 N-连接聚糖结构（Hamiltonand Gerngross, 2〇 07)。然而, 其他研究人员只能使用Roland Contreras研究小组开发的菌株，而且必须得到Research Corporation Technologies的许可。对毕赤酵母中O■连接聚糖的结构研究还不很充分，但已知其是通过在丝氨酸/苏氨酸残基上添加1〜4 个甘露糖残基形成的（Goto, 2007; Trimble et al.， 20 〇 4)。已有数个报道指出，某些特定蛋白质在毕赤酵母中表达时会被添加O 连接聚糖，而在哺乳动物细胞中的内源性表达却不会这样（Daly and Hearn， 2005)。

四、杆状病毒/昆虫细胞

在昆虫细胞中由杆状病毒(baculovirus)介导的蛋白质表达为重组蛋白制备提供了另外一种手段(详见第 14章）。杆状病毒是一种裂解性的（lytic) 、大的（130 k b )双链 D N A病毒，其中桃木菌属(Awi呀病毒是最常用于重组蛋白表达的杆状病毒。杆状病毒通常在来源于秋天彳了军虫草地贪夜蛾（fall a r m y w o r m Spodoptera frugiperda )(Sf 9 、Sf 2 1 ) 的昆虫细胞系中进行增殖, 而重组蛋白的表达既可在上述细胞系中完成，也可在来源于拟尺罐粉纹夜蛾（cabbage looper Tii) 的细胞（H i g hFive)中进行(Kost etal. ， 2〇〇5)。起初，构建重组杆状病毒的工作涉及将具有杆状病毒

D N A 侧翼序列的目标基因与杆状病毒的D N A 共转染昆虫细胞(insect cell) , 然后筛选出稀有的同源重组体。重组体的鉴定是通过筛选形态改变的空斑(plaque)来实现的，而且通常需要另外的多轮空斑筛选以确保制备的重组病毒中未污染有野生型病毒。这种耗时耗力的重组病毒制备方法在大多数时候已经被位点特异性转座技术(Bac^to-Bac或 Ba c uIoDirect, Invitrogen) 和改良的同源重组技术 (该技术使用在 orfi62 9 含有一个致死突变的工程杆状病毒）（来自 Oxford Expression Technologies 的 flashBAC, 或来自 E M D ——N o -v a g e n 的 B a c M a g i c ) 所取代。因为其重组效率为 100%, 这两种方法都省略了分离空斑的操作。1 轮或 2 轮的重组病毒扩增后，研究人员可以使用空斑分析法、更新颖更快速的实时定量 PC R法或基于抗体的分析法对杆状病毒的浓缩液进行定量（Hitchm a n et al. ，2007; K w o n et a l .， 2〇 02)。重组杆状病毒构建和定量方法上的进步已经极大地减少了使用杆状病毒进行表达的时间—- 缩短至大约3 周，这其中包含为了优化表达而耗费的时间。

杆状病毒表达系统中最常用的是polH 启动子和 plO启动子，二者均能在杆状病毒感染的晚期经诱导产生高水平的表(Ikonomou e t a l . ， 2003)。在此阶段, 细胞开始死亡，并伴随着蛋白酶的释放，这些蛋白酶可能会导致重组蛋白降解。为了减少重组蛋白的酶解，已经使用了在细胞裂解周期中较早阶段激活的启动子，如基本启动子（basic prom oter) (Ikonomou et al. ， 2003) 。 CA£A 和1)——〇1执基因分别编码几丁质酶（chitinase) 及一种组织蛋白酶(cathepsin protease)，也可以通过构建二者的基因缺陷型以尽量降低蛋白质水解的作用（Monsma and Scott, 1997)。

杆状病毒介导的蛋白质表达通常既能用于制备胞质表达的重组蛋白，又能用于获取分泌表达的重组蛋白。高效的分泌表达一般需要信号肽的参与。昆虫和哺乳动物的信号序列都能引导重组蛋白进入昆虫细胞的分泌途径。起初，昆虫细胞的培养是在含血清的培养基中进行，这使分泌蛋白的纯化变得复杂。近来新研发的培养基允许使用动物组织或植物组织的蛋白质水解液代替血清，从而大大简化了蛋白质的纯化 (Ikonomou et al. ，2003)。不过，这种特殊的培养基造价高昂，限制了它在大规模生产中的应用。

昆虫细胞能有效地在重组蛋白中形成二硫键，也能进行绝大部分发现于哺乳动物细胞的翻译后修饰。然而，大部分昆虫细胞中形成的JV-连接聚糖都是岩藻糖苷寡甘露糖(fucosylatedpaucimannose)结构（Man3 GlcNAc2-N-A sn) (H arrison and Jarvis, 200 6;Jenkins e ta l. ，1 9 % ) 。这一发现促使人们于最近构建了能够产生含有常见于哺乳动物细胞中的复杂N -连接聚糖的糖蛋白的昆虫细胞系（Harrison and Jarvis, 2006)。一个能够表达数种糖基转移酶的转基因 S f-9 昆虫细胞系已实现了商业化（Mimiccelllin eInvitrogen), 其产生的 N -连接聚糖包含一个双触须样唾液酸化(sialylated)结构。目前仅有几篇文献描述了昆虫细胞产生的O 连接聚糖的结构(Chen et a l . ， 1991; Sugyiama eta l . ， 1993; Thomsen et a l . ， 2004)。

五、哺乳动物细胞

以前通常认为哺乳动物表达方法是重组蛋白表达效率最低的方法。然而，最近的研究进展已经极大地提高了哺乳动物细胞系的表达水平(详见第 15章)。例如, 有报道称利用稳定转染的中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,C H O )细胞，重组抗体的表达水平可以达到几个毫克每升(Figueroa e t a l . ， 2007; W urm, 2004)。虽然目前已经测试了多种细胞系和表达策略，但本章我们主要关注人胚肾（human embryonic kidney,H E K 293)细胞的瞬时转染和C H O 细胞的稳定转染。

H E K 293 细胞系来源于腺病毒转化的人胚胎肾细胞。利用特定的转染试剂，如阳离子脂质体（cationic lipids) 、憐酸耗（calcium ph o sp h ate)或聚乙烯亚胺（polyethyleneim in e)，H E K 2 93细胞能够实现较高的瞬时转染效率（> 8 0 % )(D u ro ch er et aL , 2002;Jo rd an etaL , 1996)。对于大规模的瞬时转染( > i 〇 0 mL)，相比阳离子脂质体，以磷酸钙或聚乙嫌亚胺作为转染试剂是更加经济高效的选择 (Baldi et a L ， 2007)。已经有人进行了生物反应器级别的瞬时转染，不过对于大多数实验室来说, 这个规模在技术上还是很有挑战性的 (G irard etal. , 2002)。瞬时转染技术相对简单，而且对于给定的重组蛋白，其评估可在 2 周内完成。

当需要大量的重组蛋白时，通常选择 C H O 细胞作为哺乳动物表达系统。例如，当前市场上大部分治疗用抗体就是用该细胞系生产的。标准的稳定转染 C H O 细胞表达技术涉及使用具有二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase,D H FR) 选择标记表达框和目标基因表达框的载体转染 D H F R 缺陷型的 CH◦ 细胞（W urm ，2004)。二氢叶酸还原酶能将二氢叶酸（dihydrofolate) 还原为四氢叶酸（tetrahydrofolate)，后者对于嘌呤（purine)、特定的氨基酸和脱氧胸苷酸 (thymidylic acid)的从头合成是必需的。氨甲蝶呤 (methotrexate)能结合并抑制 D H FR，可作为选择试剂使用，只有整合了 DHFR 选择标记表达框的细胞才能存活。连续提高氨甲蝶呤的浓度能造成 D H F R 基因及与其相连的目的基因的大量扩增。经过至少一轮的氨甲蝶呤筛选后, 利用有限稀释法将稳定转染的细胞克隆到多孔板中，就实现了稳定转染细胞群的亚克隆。通常的情况是，筛选得到的亚克隆中只有小部分能够以较高的水平表达重组基因，因为大部分克隆中表达框都整合到了转录不活跃的异染色质区域。不幸的是，整个选择和筛选的过程需要至少 2〜3 个月，这是 CHO表达方法最主要的缺点。不过，目前基于流式技术和自动化技术的高通量技术已经大大简化了高表达克隆的快速筛选和选择 (Browne and Al-Rubeai，2007)。另外一个进展是利用位于重组基因表达框两侧的特异性顺式作用 D N A 元件 (e x a c tin g DNA element),它们可以使整合位点的转录变得活跃 (Kwaks and O tte，2006)。不幸的是，大部分此类D N A 元件由公司拥有，实验室使用时必须得到公司的许可。此外，即使有了上述的进展，获得高表达 C H O 克隆株需要的时间依然没有太大的变化。

哺乳动物表达系统主要用于制备分泌的重组蛋白，而不是制备胞内表达的蛋白质。已经开发出了针对 C H O 和 HEK293细胞系的无血清培养基, 这使分泌表达的重组蛋白的纯化变得简单。不过, 这种培养基价格不菲，使得大规模的生产非常昂贵。

相较于其他表达系统的宿主，哺乳动物细胞具有最出色的蛋白质折叠和二硫键形成能力。哺乳动物细胞生成的N-连接聚糖和 0-连接聚糖的结构变化很大，这不仅取决于蛋白质，也与作为表达宿主的哺乳动物细胞的类型相关（Jenkins et al., 1996)。此外，细胞的培养条件，如营养成分、p H 、温度、氧气的水平以及氨浓度都能够对糖基化产生显著的影响 (Butler，2006)。 JV-连接糖基化的糖会是寡聚甘露糖(〇 lig 〇 mannose)、杂合聚糖及别的复杂聚糖结构，但所有的结构都会包含— 个 Man3 GlcNac2 核心（Bhatia and Mukhopadhyay，1998)。寡甘露糖聚糖有 2〜6 个附加的甘露糖残基，这些残基可被磷酸化或硫酸化。最常见的复杂聚糖结构具有 2〜4 个连接于甘露糖的 Gal ，4-GlcNac2 基团，它能够形成 2 个、3 个和 4 个触须样的分支结构。分支结构末端为唾液酸，分支上还可连接岩藻糖。杂合聚糖同时具有寡聚甘露糖和复杂聚糖结构的特征^ 可根据其核心结构将O 连接糖基化结构分为 8 类 : 0 乙醜半乳糖胺型糖基化(〇 GalN Ac-type glycosylation)、O-乙酰氨基葡糖型糖基化（O G lcN A otype glycosylation)、O-岩藻糖基化（Ofucosylation)、O-甘•糖基化（Om annosyiation)、O-葡糖基化（O glucosylation)、憐酸糖基化(phosphoglycosylation)、O-葡糖胺聚糖型糖基化（〇 ——glyc 〇 saminoglycan-type glycosyiation)和胶原型糖基化（collagen-type glycosylation) (Peter-Katalinic，2005)。

六、蛋白质的特性

在选择表达系统时, 可以很容易地通过文献调研来确认重组蛋白之前是否已被表达过并对公开出版的表达策略做出评估。借鉴文献报道时，考虑清楚文献中重组蛋白的应用目的与你的预期应用是否相似或相容是很重要的。缺少文献信息时，表达或详细介绍同源蛋白的报道也是很有用的。在过去的十年，表达的蛋白质的数目有了戏剧性地增加，这在一定程度上归功于多种基因组序列的测定、高通量表达方法的发展以及大规模的蛋白质结构计划（protein structure initiative,P S I )。这种趋势很可能会持续下去，这意味着最终前人的大量数据可以使表达系统的选择变得更加简单容易。

1. 蛋白质的特性：大肠杆菌与密码子用法

—般来说，在重组蛋白表达宿主的选择中，对原核来源的蛋白质应当只选择大肠杆菌进行表达，而不是真核表达系统, 因为通常真核生物的翻译后修饰能力和改善的折叠能力对原核蛋白来说是不必要的，甚至是不想要的。对于真核蛋白来说情况就不同了，因为有大量的实例表明，真核蛋白能在大肠杆菌中进行成功地表达（Sahdev et al. ， 2008)。当使用原核系统表达真核蛋白时，一个非常重要的考虑是: 像所有生物一样，大肠杆菌对密码子的使用有偏性，其 t R N A 丰度反映了这一•偏性（Gustafsson et al. ， 2004; M a r i n ，2008)。表达含有数个大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白时会受对应的 t R N A 丰度的限制而效率不高。 tR N A 短缺会导致翻译移框、氨基酸错误掺入及翻译提前终止等。这个问题在稀有密码子集中分布于 N 端时尤其明显（K a n e , 1995)。不过, 通过合成密码子优化的基因或者使用稀有密码子 t R N A 丰度增加的商业化工程菌株（如 R osetta 菌株，E M D ——N o v a g e n ) 可以避免这个问题。在多数情况下, 如果重组基因是在亲缘关系很远的生物宿主中表达, 密码子偏性也需要加以矫正。

2. 蛋白质的特性: 胞质蛋白

对于胞质蛋白来说，选择最佳的表达系统取决于蛋白质的大小和分子内二硫键的数目。对于分子质量为10〜50 kD a 并含有极少二硫键的蛋白质而言，大肠杆菌是实现蛋白质可溶性表达的很好选择（D y s o n e ta L ， 2004)。对于更大或具有许多二硫键的蛋白质来说，如果需要可溶性表达，那么通常应优先选择杆状病毒或酵母表达系统。对于10 k D a 以下，有极少甚至没有二硫键的蛋白质，已通过融合可溶性标签，在大肠杆菌中实现了成功表达（Esposito and Chatterjee, 2006)。或者, 也可以将这些小蛋白质在毕赤酵母中进行分泌表达(Daly and H earn, 2005)。然而，在这一途径中, 必须小心监测，因为正常情况下存在于胞内的蛋白质被强制进入分泌途径时可能出现无意产生的糖基化。这可以通过检查序列确认其不含一致的N-连接糖基化位点来实现。遗憾的是，对于〇-连接糖基化，没有保守序列，所以必须对分泌的重组蛋白进行分析以确保其不含〇-连接聚糖。

3. 蛋白质的特性：分泌蛋白

所有的表达宿主都可用于生产分泌蛋白。不过，正如之前所述，大肠杆菌缺少大部分发现于真核生物中的翻译后修饰功能。因此，大肠杆菌可能不适于表达分泌的真核蛋白，不过这也在很大程度上取决于下游的应用。

4. 蛋白质的特性: 膜蛋白

对于蛋白质的大量表达来说，膜蛋白极具挑战性。在某些情况下，只表达可溶的、亲水的部分就足够了，此时可以移除跨膜结构域，表达可溶部分。对于完整膜蛋白的表达，如何选择最佳的表达系统还没有明确的指导原则 (Sarramegna et al. ，2003)。不过，对于大部分真核膜蛋白，由于在折叠和翻译后修饰能力上的限制，大肠杆菌表达系统通常不是一个很好的选择。相对的，研究者已报道利用杆状病毒和酵母表达系统在一定程度上成功地实现了 G 蛋白偶联受体的表达。

5. 蛋白质的特性: 毒性蛋白

对表达宿主有毒的重组蛋白会给表达带来挑战, 不过这通常是可以克服的。如果重组蛋白有毒性，确定其毒性是否具有宿主细胞特异性通常是有用的。如果是的话，那么可以选择在一个相容性更好的表达宿主中进行表达。另一个选择是使用严格调控的、可诱导的表达系统，如在大肠杆菌和毕赤酵母中应用的那些表达系统。例如，已经开发了数个精确调控的可诱导大肠杆菌表达系统(Saida, 2007)。在这些系统中，重组基因的表达由可诱导启动子、转录终止子、质粒拷贝数的控制或重组基因编码序列的修饰来调控。在可用的毕赤酵母系统中，A O X l 启动子受诱导机制以及阻遏/去阻遏方法的联合严格调控(Daly and H eam , 2005)。另外，有数项研究表明杆状病毒/昆虫表达系统可用于表达毒性蛋白（Aguiar et al., 2:006; Korth and Levings，1993)。最后，对于哺乳动物表达系统来说，最简单的选择是瞬转表达。 C H O 细胞中的数种可诱导表达系统都需要花费相当多的时间以完成必要的细胞工程改造，而且利用这些表达系统很难获得严格调控的基因表达，而这种严格调控对于防止细胞死亡来说是必需的 (Rossi and Blau, 1998)。

七.重组蛋白的应用

用于结构研究时，重组蛋白的表达要求正确的蛋白质折叠、形成正确的二硫键、均一的重组产物。前面已经介绍了每种表达系统的蛋白质折叠和二硫键形成的内在能力。不均一性的潜在来源包括鱗酸化、甲硫氣酸氣肤酶(methionineaminopeptidase) 对起始甲硫氨酸的低效切割以及糖基化。不幸的是, 不均一的磷酸化常见于重组蛋白激酶的表达,并且每一种表达宿主都有类似报道。在这种情况下, 可以通过磷酸酶处理去除重组蛋白上的磷酸基团以获得均一性。当重组蛋白在胞内表达时，可能会出现 N 端甲硫氨酸的不均一性。原核生物和真核生物都含有甲硫氨酸氨肽酶，甲硫氨酸的切割效率受起始甲硫氨酸相邻的氨基酸的影响 (Giglione etal., 2004)。通常，该相邻氨基酸侧链的大小与甲硫氨酸切割的效率负相关。然而，在大肠杆菌中，高水平表达的重组蛋白会使酶达到饱和，并改变有效切割的相关规则 (Dong etal.，1996)。这种不均一性可以通过小心选择起始甲硫氨酸的相邻氨基酸或利用 N 端的可切割的标签来避免。糖基化的不均一性可见于糖蛋白在所有真核生物中的表达。不过在昆虫或酵母宿主中这种不均一性通常会低一些 (Jenkins etal. ，1996)。无论采用何种表达宿主, 通常会在试图对重组蛋白进行结晶前除去糖基团。

正常情况下，若制备的重组蛋白用做免疫用抗原时，任何表达宿主都是可用的。对于糖蛋白来说，有时还不清楚聚糖的存在是否会改变重组抗原的免疫原性（Bhatia andMukhopadhyay, 1998； Prasad et al., 1995)

适用于体外活性研究及体内实验的重组蛋白的制备要求蛋白质正确折叠和二硫键正确形成。对于糖蛋白来说，N -连接聚糖的存在以及聚糖基团的结构对这两类应用都有重要的影响，因此在选择真核表达宿主时必须加以考虑。研究表明，JV-连接聚糖对蛋白质的结构有积极的影响并增加了蛋白质的稳定性 (Bhatia and M u k h o p a d h y a y , 1998)。在体外，已有研究显示, 某些蛋白质配基上的N -连接聚糖的结构会影响其与受体结合的亲和力及信号转导。在重组免疫球蛋白中，F c 区保守的 N -连接聚糖影响了其在体外的效应活性(Presta, 2008)。例如，人 I g G l 的 N -连接聚糖中岩藻糖的存在降低了抗体依赖的细胞毒性活性(Shinkawa etal.， 2003)。在体内，蛋白质上 N -连接聚糖结构极大地影响了其代谢清除和生物分布。例如，无唾液酸帽的 N -连接聚糖会被肝受体 (hepatic receptor),清除这类受体包括脱唾液酸糖蛋白(asialoglycoprotein) 受体和甘露糖受体（Weigeland Yik， 2002)。 O-连接糖基化的重要性还不明确。如果重组蛋白的糖基化修饰作用还不清楚，那么比较安全的策略是选择与重组基因来源宿主相似的表达宿主。

八.结论

大肠杆菌、毕赤酵母、杆状病毒/昆虫细胞及哺乳动物表达系统在表达重组蛋白方面各有其优缺点 (表 11.1)。一个给定的表达系统能否高水平表达蛋白质并获得高质量的产品, 这在很大程度上取决于该蛋白质。在选择表达方法时，必须认真地评估重组蛋白的特性及下游的应用。不幸的是，有时候表达方法的选择并不是显而易见的，此时必须对数种表达宿主进行评估。