水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA
实验概要
学习水平式琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度、构型、含量和分子量大小。
实验原理
闭合环状质粒、线性质粒和开环质粒DNA由于构形不同，在加溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳上呈现不同的迁移率，因而在紫外灯下观察，能区别闭合环状质粒 DNA（cccDNA）、线性质粒DNA（L-DNA）和开环质粒DNA（ocDNA）。
主要试剂
1. l DNA/HindIII分子量标准
2. 溴酚蓝指示剂点样缓冲液
0.2% 溴酚蓝
50% 蔗糖
3. 1mg/ml溴化乙锭溶液
4. 电泳缓冲液（TAE）
40 mmol/l Tris-乙酸
1 mol/l EDTA
(配制方法：24.2克Tris碱，5.71ml冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至5000ml）
5. 0.7% 琼脂糖凝胶
（配制方法：称取琼脂糖0.35克，加入50ml TAE电泳缓冲液）
主要设备
1. 微量移液器
2. 电泳仪
3. 水平电泳槽
4. 透射紫外观察仪
实验材料
质粒pUC118
实验步骤
1. 选择合适的水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平。检查稳压电源与正负极的线路。
2. 选择孔径大小合适的点样梳子，垂直架在电泳胶模的一端，使点样梳子底部离电泳胶模底部的距离为1.0mm。
3. 制备0.7%琼脂糖凝胶，100℃水浴加热至琼脂糖融化均匀。
4. 用吸管取少量琼脂糖凝胶溶液将电泳胶模四周密封好，防止浇灌琼脂糖凝胶板时发生渗透。待琼脂糖凝胶冷却至60℃左右时，加入一滴溴化乙锭，摇匀，轻轻倒入电泳胶模中，琼脂糖凝胶的厚度在3～5mm。倒胶时要避免产生气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。
5. 琼脂糖凝胶凝固后，在室温放置20分钟，小心拔掉点样梳子和电泳胶模两端的挡板，保持点样孔的完好。
6. 将电泳胶模放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，使电泳缓冲液面高出琼脂糖凝胶表面1～2mm。如点样孔内有气泡，用吸管小心吸出，以免影响加样。
7. 将15ml DNA样品与1/5体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液混合。上样缓冲液不仅可以提高样品的密度，使样品均匀沉到样品孔内，还可以使样品带颜色，便于上样和估计电泳时间和判断电泳的位置。
8. 用微量移液器将样品小心加入加样孔内，记录样品点样秩序。
9. 盖上电泳槽，开启电源开关，最高电压不超过5V/cm（100～150V恒压电泳），使DNA从负极向正极移动。
10. 电泳时间随实验的具体要求而异。电泳一般需1～3小时。电泳完毕后关闭电源，戴一次性塑料手套取出凝胶，尽可能将所有的电泳缓冲液淋干，在 254nm波长的透射紫外灯下观察。
注意事项
1. 加热溶解琼脂糖时应不断地摇动容器，使附于壁上的颗粒也完全溶解。
2. 溴化乙锭是一种强致癌剂，并有中度毒性，因此必须十分谨慎小心。操作时一定要戴手套，用过的手套要及时将手套顺手翻过来，让污染有溴化乙锭的面朝里。
3. 用254nm波长的紫外光进行观察的效果比366nm清晰，但产生的切口DNA量也较高。紫外光对眼睛有害，观察时应戴上眼镜或防护面罩。
