金黄色葡萄球菌、沙门氏菌快速检测方法
在发达国家以及发展中国家，食源性致病菌引发的疾病已经成为严重威胁公众健康的重要因素[1,2]。金黄色葡萄球菌（StaphylococcusAureus）是引发多种类型感染和食物中毒的病原菌，由此引发的食物中毒发生频率很高[3]。沙门氏菌是最常见的食源性致病菌，也是食源性致病菌中研究最活跃的细菌[4]。沙门氏菌大多数由食物传播，少数可通过水介质传播，可引起多种肠道性疾病及食物中毒[5]，是世界上分布最广泛的致病菌之一。
传统的检测方法检测食品中的致病菌存在周期长、步骤繁琐等缺点，如何快速准确地检测食品中的致病菌已经成为当前的研究热点[6]，快速而准确的检测食源性致病菌的方法变得越来越重要[7,8]。
实时荧光定量PCR融汇了PCR技术的核酸高效扩增、探针技术的高特异性以及荧光技术的高敏感性[9]，在食源性致病菌的检测上已经得到了广泛的应用。
本研究对使用实时定量PCR原理的金黄色葡萄球菌/沙门氏菌核酸检测试剂盒进行了多方面的评价，为食品安全检测中金黄色葡萄球菌/沙门氏菌的检测提供了一种快速准确的检测手段。
实验材料
样本
奶粉、巴氏奶、纯奶、发酵乳。
菌株
金黄色葡萄球菌阳性菌株：
ATCC27217、ATCC26113、ATCC25923、ATCC29213、ATCC6071、CMCC（B）26003、ATCC6538、ATCC26112、ATCC33591、ATCC43300、FSCC（I）223189等标准菌株及金黄色葡萄球菌分离株共1177株；
金黄色葡萄球菌干扰菌株：
CMCC26069表皮葡萄球菌、ATCC29544阪崎肠杆菌、ATCC25922大肠杆菌、ATCC29212粪肠球菌、ATCC8090弗氏柠檬酸杆菌、CMCC51572福氏志贺氏菌、ATCC10792苏云金芽孢杆菌、CMCC49027变形杆菌、CMCC52202小肠结肠炎耶尔森氏菌、ATCC25922大肠埃希氏菌、ATCC19115单增李斯特菌、CMCC51252痢疾志贺氏菌、CMCC63301蜡样芽胞杆菌、ATCC27853铜绿假单胞菌、ATCC11774枯草芽孢杆菌、ATCC33560空肠弯曲菌、CMCC50333沙门氏菌等非金黄色葡萄球菌标准菌株17株；
沙门氏菌阳性菌株：
CICC21482、CMCC50333、CMCC50220、ATCC14028、CMCC(B)50115、CMCC(B)50071、CMCC(B)50335、CMCC(B)50093、CMCC(B)50094、CICC21480、CICC21488、CICC21489、CICC21497、CICC21498、CICC21586、ATCC7001、ATCC35640、ATCC9842、ATCC13314、ATCC9150、ATCC29934、CMCC50041等标准菌株及沙门氏菌分离株共643株；
沙门氏菌干扰菌株：
CMCC26069表皮葡萄球菌、ATCC29544阪崎肠杆菌、ATCC25922大肠杆菌、ATCC29212粪肠球菌、ATCC8090弗氏柠檬酸杆菌、CMCC51572福氏志贺氏菌、ATCC10792苏云金芽孢杆菌、CMCC49027变形杆菌、CMCC52202小肠结肠炎耶尔森氏菌、ATCC25922大肠埃希氏菌、ATCC19115单增李斯特菌、CMCC51252痢疾志贺氏菌、CMCC63301蜡样芽胞杆菌、ATCC27853铜绿假单胞菌、ATCC11774枯草芽孢杆菌、ATCC33560空肠弯曲菌、ATCC27217金黄色葡萄球菌等非沙门氏菌标准菌株17株。
主要试剂
金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒（PCR-探针法）LR70501、沙门氏菌核酸检测试剂盒（PCR-探针法）LR70601。
7.5%NaCl肉汤、BPW、BP平板、血平板、血浆凝固酶试剂、SC、TTB、XLD平板、BS平板、TSI、赖氨酸、NA、靛基质、尿素、氰化钾等培养基。
主要仪器
实时荧光PCR仪：雅睿MA-6000P、伯乐CFX96。恒温培养箱、离心机（2mL）、掌式离心机（0.2mL8联管）、金属浴、涡旋混合器、移液器（10、100、1000μL）及吸头、离心管（2mL）、PCR反应管（0.2mL）等。
实验方法
识别性及特异性检测
用金黄色葡萄球菌/沙门氏菌核酸检测试剂盒（PCR-探针法）对金黄色葡萄球菌/沙门氏菌阳性菌株（标准株及分离株）及其干扰菌株进行检测并记录检测结果。
灵敏度检测
取金黄色葡萄球菌/沙门氏菌标准菌株增菌液，分别稀释到101、102、103、104CFU/mL，并进行核酸提取及PCR检测，每株标准株每个浓度进行10次实验，10次检测都是阳性的最低浓度即为金黄色葡萄球菌/沙门氏菌核酸检测试剂盒（PCR探针法）对该菌株的检测灵敏度[10]。
取样品（奶粉、巴氏奶、纯牛奶以及发酵乳）25g（mL），加入225mL、7.5%NaCl肉汤/BPW；取金黄色葡萄球菌ATCC27217/沙门氏菌CICC21498标准菌株增菌液添加到稀释好的样品中，使终浓度分别为101、102、103、104CFU/mL，并取1mL进行核酸提取及PCR检测；每种样品每个浓度进行10次实验，10次检测都是阳性的最低浓度即为金黄色葡萄球菌/沙门氏菌核酸检测试剂盒（PCR-探针法）对样品（奶粉、巴氏奶、纯牛奶以及发酵乳）中金黄色葡萄球菌/沙门氏菌的检测灵敏度。
增菌浓度及验证实验
取样品（阴性发酵乳）25g，加入225mL，7.5%NaCl肉汤/BPW，添加金黄色葡萄球菌ATCC27217/沙门氏菌CICC21498约2CFU，重复30次，37℃增菌18h，对增菌后的样本进行金黄色葡萄球菌/沙门氏菌的计数并按照国标进行进一步的验证，记录阳性样本的金黄色葡萄球菌/沙门氏菌浓度（CFU/mL）。
取30份样品（发酵乳），每份取25g，加入225mL，7.5%NaCl肉汤/BPW；然后再取25g，加入225mL 7.5%NaCl肉汤/BPW，添加金黄色葡萄球菌ATCC27217/沙门氏菌CICC21498约100CFU。37℃增菌18h，从中取1mL进行核酸提取并使用金黄色葡萄球菌/沙门氏菌核酸检测试剂盒进行检测，其余增菌液按照国标方法继续检测并记录最终检测结果。
结果与分析
识别性和特异性检测
金黄色葡萄球菌/沙门氏菌核酸检测试剂盒对金黄色葡萄球菌/沙门氏菌阳性菌株及干扰菌的检测结果如表1a/表1b，金黄色葡萄球菌/沙门氏菌核酸检测试剂盒（PCR-探针法）对金黄色葡萄球菌/沙门氏菌的识别性和特异性均为100%。
表1a金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒识别性和特异性
菌株数量 | PCR阳性数量 | |
金黄色葡萄球菌标准株 | 11 | 11 |
金黄色葡萄球菌分离株 | 1166 | 1166 |
非金黄色葡萄球菌 | 17 | 0 |
表1b沙门氏菌核酸检测试剂盒识别性和特异性
菌株数量 | PCR阳性数量 | |
沙门氏菌标准株 | 22 | 22 |
沙门氏菌分离株 | 621 | 621 |
非沙门氏菌 | 17 | 0 |
灵敏度检测
金黄色萄球菌/沙门氏菌核酸检测试剂盒对不同的金黄色葡萄球菌/沙门氏菌标准菌株检测灵敏度如表2a/表2b所示，金黄色萄球菌/沙门氏菌核酸检测试剂盒对金黄色葡萄球菌/沙门氏菌标准菌株的检测灵敏度为100CFU/mL。
表2a金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒检测灵敏度
菌株编号 | 灵敏度（CFU/mL） |
ATCC 27217 | 100 |
ATCC 26113 | 100 |
ATCC 25923 | 100 |
ATCC 29213 | 100 |
ATCC 6071 | 100 |
CMCC(B）26003 | 100 |
ATCC6538 | 100 |
ATCC26112 | 100 |
ATCC33591 | 100 |
ATCC43300 | 100 |
FSCC（I）223189 | 100 |
表2b沙门氏菌核酸检测试剂盒检测灵敏度
CICC21482 | 100 |
CMCC50333 | 100 |
CMCC50220 | 100 |
ATCC14028 | 100 |
CMCC(B)50115 | 100 |
CMCC(B)50071 | 100 |
CMCC(B)50335 | 100 |
CMCC(B)50093 | 100 |
CMCC(B)50094 | 100 |
CICC21480 | 100 |
CICC21488 | 100 |
CICC21489 | 100 |
CICC21497 | 100 |
CICC21498 | 100 |
CICC21586 | 100 |
ATCC7001 | 100 |
ATCC35640 | 100 |
ATCC9842 | 100 |
ATCC13314 | 100 |
