色谱仪峰形后拖如何解决？
一、概述
高效液相色谱方法的开发过程中，一个总的原则是：先找到目标化合物的峰，然后调整峰形，再是进一步完善。本文主要介绍调整峰形中峰形后拖的解决方案。
二、峰形后拖常见形式及原因
在这里撇开所有的污染、塌陷、死体积等其它因素，假设系统是好的，柱子是新的、好的，单纯探讨液相方法与峰形后拖之间的关系，通过调整液相方法来解决峰形前拖的问题。这样有利于厘清拖尾产生的根本原因，对峰形拖尾的问题提供一些经验上解决方案。
系统是好的，柱子是好的，为什么会产生后拖？我们还是回顾一下，色谱分离的一般过程，正常的峰形应该是样品在色谱柱上均匀前移的情况下得到的，浓度分布在整个通过色谱柱柱床的过程中任何时候都呈正态分布。
色谱分离是一个物理过程，样品分子经过在固定相与流动相之间的多次分配、吸附解吸，由于不同分子与固定相和流动相之间的相互作用力的差异而使它们在色谱柱中的移动速度不同，以此实现分离的目的。相同色谱条件下，有些化合物容易产生拖尾，有些则不产生拖尾，这说明拖尾的产生跟样品本身的性质是密切相关的，通常非极性和弱极性的化合物能获得良好的峰形，而带有－COOH、－NH2、－NHR、－NR2等极性基团的化合物则比较容易产生拖尾。
可以想象一下，样品分子在分析过程所处的环境，一是流动相，二是固定相，流动相可以自由流动的，均一性比较好，因此可以认为样品分子四周都被相同组成的流动相所包围，其对每个样品分子的相互作用力也是均匀的、对称的，不应该是引起浓度分布发生变化的主要原因。考虑固定相，固定相中除了C18长链外还有填料键合时残余的硅羟基，由于C18长链是非极性的，其与样品分子的相互作用力也是很微弱的范德华力，而硅羟基则具有一定的极性Si－Oδ－Hδ＋，在pH一定的条件下甚至还会发生电离，形成－Si－O－ 形式的离子态。Si－Oδ－Hδ＋和－Si－O－对于极性化合物之间的作用力则是一种极性的静电作用力，这种作用力比范德华力要强得多，同时，因为硅胶表面键合了C18长链，由于空间位阻作用，样品分子中能接触到残余硅羟基的机会不会很多，只有少部分的分子才能与残余硅羟基产生作用。这样，大多数的样品分子如非极性分子一样均匀前移，而少量的样品分子由于这种静电作用力的存在而被推迟洗脱出来，导致样品分子的浓度分布发生变化，产生后拖。拖尾严重的程度与样品分子极性大小和残余硅羟基的多少有着直接的关系。残余硅羟基对样品的次级保留效应是导致峰形后拖的主要原因。
三、峰形后拖解决方法
发现峰形后拖时，建议按下面的步骤逐步排除可能的原因，然后找到相应的对策，消除峰形后拖的状况、改善峰形。
1、先检查一下是否是样品过载
样品过载，通常会引起峰形变差，导致前拖、后拖或平头峰，如果出现平头峰、峰高超过2000mAU或峰很高的同时又前拖、后拖得很厉害通常都认为是过载的，但这一点也并不绝对，因为不同化合物的吸收强度不一样，如果一种化合物在某一波长处有强吸收，即使出现了平头峰，样品也不一定过载，这与仪器和软件有关；相反如果吸收弱，则高浓度条件下峰也不见得有多高；所以样品是否过载应该结合浓度、进样体积和峰形一起来判断。通常认为峰高在100mAU左右比较合适，不至于因过载影响峰形。由于样品过载引起的峰形后拖不容易消除，也可能根本无法消除，继续采用以下的峰形改善措施可能不会有什么作用，而且在过载的情况下无法看清正常浓度时样品真实的分离状况和峰形，因此需要优先考虑是否过载，否则继续往下调整峰形的努力将无任何意义。
如果发现过载，需降低进样量（包括进样体积或浓度），但不管怎么样，减少进样量通常对改善峰形总是有益的，一般而言，进样量越小，峰形越好。
2、往流动相中加入酸
根据这一解释，往流动相中加酸将流动相的pH调至2.5以下有助于改善峰形，这种方式，主要用于改善对带羧基化合物的拖尾。
碱性化合物中，容易发生拖尾的化合物中通常包含着－NH2、－NHR、－NR2，即伯、仲、叔三种富电荷的极性基团，它们的碱性强弱顺序为：－NH2 < －NHR < －NR2，其碱性强弱跟与N原子直接相连的基团有关，吸电子基团会削弱这种碱性，供电子基团（如烷基）则使之增强。伯氨中甲胺的碱性最弱，以它为例更具有代表性，甲胺的pKa为10.64，那么在pH<8.64的时候它是完全呈离子态的，也就是－NH3＋，那么pH在2.5~8.64时，特别是pH6.7～8.64时，因为此时带氨基的化合物和硅羟基均以离子状态－NH3＋和Si－O－形式存在的，它们之间相互吸引的静电作用导致后拖，这就是为什么很多碱性化合物在pH 7.0的条件下容易产生拖尾的原因，而很多色谱柱生产商也因此以阿米替林（含－N(CH3)2，碱性比－NH2强）在pH 7.0的条件下来评价和比较不同色谱柱之间的优劣，该条件下的阿米替林的峰形越好说明封尾越好，封尾工艺成功的阻止了残余硅羟基与样品分子的接触。而在pH<2.5的条件下，也仍然后拖，是因为－NH3＋足够强，即使硅羟基以分子状态存在也仍能够与Si－Oδ－Hδ＋中氧原子产生吸引作用，导致峰形拖尾。当pH>12.64的时候，甲胺完全以分子状态形式存在，不会引起拖尾。所以分析有些化合物，流动相的pH需要调至强碱性条件下峰形才会变好。
3、增加缓冲盐或增大缓冲盐的浓度
流动相中加入缓冲盐，增强了流动相的离子强度，在－NH3＋等极性基团和硅羟基Si－O－之间存在着许多离子的干扰，减少了样品分子与硅羟基之间相互接触的机会，有助于削弱极性基团与硅羟基之间的相互作用，改善峰形。这种适合于碱性较弱（如氨基的N原子与强吸电子基相连），或碱性很强，但在刚性结构中，比较难以接近被C18长链和封尾试剂覆盖的硅羟基。
4、往流动相中加入三乙胺、四丁基硫酸氢铵或辛烷磺酸钠等
基于上面的解释，既然拖尾的产生是因为－NH2、－NHR、－NR2与硅羟基发生静电作用引起的，那么阻碍它们之间静电作用的途径，应该有两种，一种是占据硅羟基这个作用位点，另一种是占据－NH2、－NHR、－NR2这个作用位点。
1）流动相中加入三乙胺
在流动相中加入三乙胺，能显著的改善峰形，消除拖尾。其作用是屏蔽硅羟基，使碱性化合物在分离的过程中减少了和硅羟基相互接触的机会，失去了导致拖尾的作用位点。三乙胺的pKa为11.09，在pH<11.09－2＝9.09的条件下是以离子状态N＋H(CH2CH3)3的形式存在的，因此pH在2.5~8.64 硅羟基呈Si－O－离子态的情况下，N＋H(CH2CH3)3容易与Si－O－形成相对较强的静电吸引力，流动相中加入了三乙胺后，平衡柱子的过程中已经优先占据了硅羟基的作用位点，而带氨基的样品分子虽然在该pH条件下也呈离子状态－N＋H3、－N＋H2R或－N＋HR2 ，也能与Si－O－形成相对较强的静电吸引力，但三乙胺有先占住位点的优势，使样品分子与硅羟基的作用大大减弱，缓解了拖尾的产生；同时，流动相中存在的N＋H(CH2CH3)3仍然与样品分子中的极性基团与硅羟基的相互作用产生竞争，更进一步的削弱了样品分子与硅羟基的接触机会，改善峰形。
通常加入三乙胺的量约为2％即有显著的效果，如有需要可适当增大用量。加入三乙胺改善峰形的时候，有两点需要注意的：1）三乙胺的碱性很强，加入三乙胺后流动相的pH可能超出色谱柱的使用范围，对色谱柱造成损伤，同时，pH的改变也会导致出峰时间的显著变化，为了避免保留时间变化太大而可能引起的其它问题，因此，建议流动相中加入三乙胺后回调至未加入前的pH值，但通常即使pH回调过也仍会引起保留时间的较大变化；2）三乙胺在210nm处有比较强的吸收，如果液相方法中检测波长在210nm以下测定时需要谨慎使用，以免因加入三乙胺后本底上升，而引起峰高、峰面积下降，检测灵敏度严重降低，有些甚至看不到峰。所以三乙胺用于改善峰形，其使用范围是有一定限制的。
2）流动相中加入四烷基季铵盐等离子对试剂
由上可知，加入三乙胺能改善峰形是由于pH<9.09的条件下，三乙胺的状态为N＋H(CH2CH3)3与硅羟基的离子态Si－O－形成相对较强的静电吸引力，占据了位点，有效的阻止了氨基与硅羟基的接触造成的次级保留效应。同样，四烷基季铵盐（如四丁基硫酸氢铵、四丁基溴化铵、四丁基氢氧化铵等）在水中电离后，也形成了类似N＋H(CH2CH3)3的结构N＋(CH2CH2CH2CH3)4，这种结构也能有效的与Si－O－产生较强的静电作用，阻止氨基与硅羟基的接触，改善峰形。而且它还有一个不同于三乙胺的显著特点是，它在低波长范围的吸收比三乙胺弱。
3）流动相中加入辛烷磺酸钠等离子对试剂
流动相中加入辛烷磺酸钠等烷基磺酸盐离子对试剂也能很好的改善峰形，其作用机理与三乙胺和四丁基硫酸氢铵颇为不同。三乙胺和四丁基硫酸氢铵是通过与硅羟基的作用来阻止样品分子中的氨基与硅羟基接触，而烷基磺酸盐则是通过与样品分子的作用来阻止样品分子与硅羟基的作用来改善峰形。以庚烷磺酸钠为例，庚烷磺酸钠在水中电离成SO3－CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3而样品分子中的几种结构的氨基则大约在pH<9的条件下形成呈离子状态－N＋H3、－N＋H2R或－N＋HR2，显然，SO3－CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3能与它们形成较强的静电作用，有效的阻止了样品分子与硅羟基的作用，改善峰形。
