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细胞培养板的选择与常见问题解答(二)

2020.7.14

(4)细胞分布不均及解决办法

问:我的细胞接种培养板,细胞总是聚集在周边部分,该如何处理啊?我看园子里有的战友的细胞却是聚集在中间,是不是板子的质量问题啊?
答:请问你的细胞是如何混匀的?是滴管吹打还是振荡培养板?如果是后者,而且是转圈摇匀的话,很有可能由于离心力的作用使细胞甩到周边部分,导致细胞中间少,四周多!自己可是试试!
周边一般是相对会多一点,但是中间的数量也不会很少啊~~ 铺板的时候我也没有特异去振荡培养板。
大概是板子的质量问题吧或者是不是铺板时候的细胞密度太低了?我用的corning的板 。
一个好办法:在你培养种板之前,把培养板放入培养箱里进行几个小时的饱和后再取出,种入细胞时力量要轻,可采取用滴头在培养板孔的侧面慢慢加入让细胞悬液流入板孔中,培养的细胞基本是均匀生长。记住千万不要用振荡器振荡,否则你的细胞就会想你说得那样聚积在一起。
我今天把培养板放入培养箱里几个小时,适当的把细胞密度加大了一下,另外多加了一点培养液,今晚看细胞铺的挺好的。我认为有两种可能解决你问题的办法:1.加入前吹打均匀;2.从多孔板侧边或底边缓慢加入。

问:我在做原代培养时也遇到过这种情况,我一直以为培养皿铺胶不均匀会导致这种现象,因为混匀的血管段加入到培养皿中时,在相差显微镜下血管段均匀分布在培养皿中,24h后贴壁的血管段就是周边多,中间相对少些。下次我要试试hkqu战友的方法看能否改变这种现象。

答:这种现象很正常呀,不知你仔细观察过没有,孔直径愈小,这个现象越明显,我试过,24、96孔板这种现象不可避免,因为液体的附壁使得孔内培养液不是成一个液平面,而是周边高,就像凹镜一样,而使用这两种孔板由于需要加干预等原因而不能加足量培养液,使得细胞随培养液一起出现“边集”现象,如果为了使孔中央也有均匀细胞而增加接种细胞数量的话,这要看你需要观察何种指标,如果是MTT ,免疫组化的话会因为细胞成层而影响结果。

(5)6孔板接种和换液问题:
问:我的细胞传代很正常,但一种到六孔板里(不管加药和对照),总有两三个孔(随机)细胞长得不好,很小,像破碎了。有人遇到过这种情况吗?到底是啥原因呢?请各位指点
答:可能跟你加液的温度有关。如果你细胞刚刚拿出来换液加液,培养基也是从4度冰箱拿出来不久,很容易细胞就会冻死了。建议你最好把培养基先在培养箱里边孵育15min先。
另外,跟你细胞的生长状态也有关。加药之前的细胞可以用高点的血清浓度培养。保证细胞状态良好。
或者放在37度水浴锅里孵育也可以,或者是培养板本身的问题,你再换换其它培养板试试看。再有可能就是细胞状态问题了,种板时的血清浓度调高试一下

问:最近几天,我用六孔培养板接种细胞,培养24小时后更换培养基,在更换培养基之前,显微镜观察到细胞贴壁,状态非常的好,更换了培养基后,立即用显微镜观察,发现每个孔中都近乎有一半的细胞表现出近乎死亡的状态。细胞变得非常小,产生大量的碎片,而另一半的细胞一切正常,异常细胞与正常细胞之间存在一条分水岭,上半个圆是好的,下半个圆就不好,这是怎么一回事?

答:你可以看一下是不是培养板没放水平。有一回我也出现过这种情况。
你的培养液如何,如果培养液过期,细胞就不会贴壁。换一点新配制的培养液试一试。
我也经常碰到,我想可能是板的问题,换一个牌子的板或换用培养瓶就没问题了。
不知楼主所需换液的培养板多不多,换培养基的时候如果没有注意风机的影响,特别是所需换液的培养板很多时,容易使细胞因风吹失水而干缩破裂。如果如此,换液时应该逐个培养板进行,别怕浪费吸管,注意操作的效率!

(6)24孔板接种问题:
问:把细胞消化接种到24孔板之后,已经四天了,老是每孔的中间部分长不满,每天换液时都用PBS 清洗,第二天换液时都出现同样的情况,每孔的边缘长的很好,中央大量死细胞?

答:我是选择孔内铺盖玻片,在玻片上种植。每次换液都用PBS洗,必要的步骤吗?另外,也有可能和细胞种类有关或者和培养液有关?
我想你的培养液可能加的太少了。由于表面张力的作用,培养板的边缘液体会向上走,造成培养液面呈现一个凹面(就像量筒的液体凹面一样),中央的细胞正好在凹面的最低处,培养液少,细胞的营养不够,甚至干涸掉,空气中的氧气也会造成损伤,即使有增值过来的细胞也会死掉。
另外,检查一下培养箱底部的水是否少了,如果少了,箱内的空气湿度不够,会造成培养液挥发加快,这样即使刚加的液体不少,过一段时间,由于蒸发,液体量会减少,造成中央干涸。并且这样会改变了培养液的成分浓度,造成渗透压过高。
个人经验认为这是物理问题:24孔板小,细胞接种进去后是很难摇均匀的,结果导致细胞重贴壁后呈现四周密中间稀的状况.至于中间较多死细胞,如果是悬浮状的话,也一样是物理问题。接种后比较粗暴的碰撞,似乎对摇均匀细胞有一定效果.

在为多孔板培养的细胞换液时一定要注意,不要把培养基吸得太干,如果完全吸取,很容易造成细胞干涸,这样的话细胞会很快死亡。我有一段时间总是遇到这个问题,一个板子中总有一两个孔出现细胞大量死亡,后来发现是上面的原因。现在我做的时候如果必须把液体吸干,我会一个一个空来吸取,最多一次不超过3孔,然后马上加入液体,同时在作转染时,我会在吸液和加液时将风机关掉,这样基本上会避免细胞死亡。

同时你所说的细胞周围密而中间稀疏,大约有如下原因:
1.培养液加得太少。主要是由于液体张力的问题。
2.细胞接种后震荡太厉害了。由于离心力作用导致细胞分布到周围。

细胞分布均匀与否有一点很关键,即每种细胞是有个体差异的,别人的细胞操作不一定适合于你.所以要靠自己摸索,且找出专属于自己细胞的一套规律,有如下经验:
1.所有待接种的细胞悬液在种板前一定要用吸管混匀。
2.按资料记载,24孔板的液体量为1ml,个人也觉得1ml的量足矣。
3.接种时,要慢慢加样,且记得轻微旋转枪头,这样做对细胞均匀分布有一定效果。
4.接种后最好直接放入培养箱让细胞适应培养板这个新的环境,个人认为没有必要在室温放置一段时间。
5.根据细胞的特性,细胞均喜欢聚集在边缘生长,所以我考虑到,你的问题还有可能是接种时的细胞密度不够,导致周边密集,中间稀疏的错觉。你的拌种密度是多少?
另"要慢慢加样,且记得轻微旋转枪头"的意思就是:加样不能太快,避免细胞在一个加样处聚集,且注意在不同的部位进行加样,即边加边活动枪头,人为使细胞趋于均匀分布,我个人觉得有一定的效果,不知这次我解释清楚没有。


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