食品中肉毒毒素的检验方法和过程
肉毒毒素的简介
肉毒梭菌系革兰氏阳性厌氧菌,易于污染食品,在厌氧条件下产生很强的向神经性毒素即肉毒毒素,能引起以神经麻痹为主要症状且病死率甚高的食物中毒(称肉毒中毒)。肉毒梭菌按所产毒素的抗原特异性分为 A,B,C,D,E,F,G 等七个型,人类肉毒中毒主要由 A,B,E 型所引起,少数由F型引起。肉毒中毒是神经型食物中毒,其症状主要是神经系统症状,以对称性颅神经损害的症状为特征,如视力模糊、眼睑下垂、复视、瞳孔散大、语言障碍、吞咽困难、呼吸困难,继续发展可由于呼吸肌麻痹引起呼吸功能衰竭而死亡。
引起肉毒中毒的食品因饮食习惯、膳食组成和制作工艺的不同而有差别。我国引起中毒的食品大多是家庭自制的发酵食品,如豆瓣酱、豆酱、豆豉,臭豆腐等,有少数发生于各种不新鲜肉、蛋、鱼类食品。日本以鱼制品引起中毒者较多,美国以家庭自制罐头和肉乳制品引起中毒者为多,欧洲多见于腊肠、火腿和保藏的肉类。
肉毒毒素检测是以小白鼠腹腔注射法为标准方法。
1、样品的处理
液状检样可直接离心,固体或半固体检样须加适量(例如等量、倍量或5倍量、10倍量)明胶磷酸盐缓冲液,浸泡、研碎,然后离心。取上清液进行检测。
另取一部分上清液,调 PH 值为6.2,每9份加10%胰酶(活力1:250)水溶液1份混匀,经常轻轻搅动,37℃作用60min,进行检测。
2、检出试验
取上述离心上清液及其胰酶激活处理液,分别注射小白鼠2只,每只0.5mL,观察4天。注射液中若有肉毒毒素存在,小白鼠一般多在注射后24h内发病、死亡,主要症状为竖毛、四肢瘫软、呼吸困难、呼吸呈风箱式腰部凹陷宛如峰腰,最终死于呼吸麻痹。如遇小鼠猝死,以致症状不明显时,则可将注射液做适当稀释,重新试验。
3、确证试验
不论上清液或其胰酶激活处理液,凡能致小鼠发病、死亡者,取样分成3份进行试验1份加等量多型混合肉毒抗毒诊断血清,混匀,37℃作用30min;1份加等量明胶磷酸盐缓冲液,混匀,煮沸10min;1份加等量明胶磷酸盐缓冲液,混匀即可,不做其他处理。3份混合液分别注射小白鼠各2只,每只0.5mL,观察4天,若注射加诊断血清与煮沸加热的2份混合液的小白鼠均获保护存活,而惟有注射未经其他处理的混合液的小白鼠以特有症状死亡,则可判定检样中有肉毒毒素存在,必要时进行毒力测定及定型试验。
4、毒力测定
取已判定含有肉毒毒素的检样离心上清液用明胶磷酸盐缓冲液做成50倍、500倍及5000倍的稀释液,分别注射小白鼠各2只,每只0.5mL,观察4天。根据动物死亡情况,计算检样中所含肉毒毒素的大体毒力(LD/mL或LD/g)。例如,5倍、50倍及500倍稀释液致动物全部死亡,而注射5000倍稀释液的动物全部存活,则可大体判定检样上清液所含毒素的毒力为1000～10000LD/mL。
5、定型试验
按毒力测定结果,用明胶磷酸盐缓冲液将检样上清液稀释至所含毒素的毒力大体在10～1000LD/mL 的范围,分别与各单型肉毒抗毒诊断血清等量混匀,37℃作用30min,各注射小白鼠2只,每只0.5mL,观察4天。同时以明胶磷酸盐缓冲液代替诊断血清,与稀释毒素液等量混合作为对照,能保护动物免于发病、死亡的诊断血清型即为检样所含肉毒毒素的型别。
