【求助】PVDF转膜

最新回复

• tuuu2 (2014-1-25 16:03:39)

  
  丽春红染PVDF膜效果不好，PVDF膜用考马斯蓝染。

• sunnyB (2014-1-25 16:03:56)

  
  PVDF膜用考马斯蓝染后还能往下做吗？馊主意

• zsxan1990 (2014-1-25 16:04:12)

  
  我也用的PVDF膜，0.45um，感觉挺好啊，
  你可以延长转印时间。
  我们湿转 要3个小时。

• PCR (2014-1-25 16:04:36)

  
  PVDF 膜可以用氨基黑10B染色，不影响后续的Western检测。

• txwuyan (2014-1-25 16:04:57)

  今天我又转了一次膜（PVDF），用丽春红染色后有条带出现，但是之后条带又慢慢淡了下来，特别是MARKER都看不见了。而同实验室的其他的人转膜用的是NC膜，条带非常清晰，Marker也很清楚。我的目的蛋白分子量是17，23，26，转膜100V，一个半小时。请问我的PVDF膜（0.22um）为什么用丽春红染 的不明显，我应该怎么调整？谢谢

• dog002 (2014-1-25 16:06:13)

  　你的电泳液或转膜液没问题吧？尤其是转膜液，如果用的次数多了，转膜效果非常差的，配一次不要用超过三次！！如果重复用，下次用时加20－30ML甲醇。
  　　你是刚接触还是已经做了几次了？你所用的转膜条件是原来你们实验室用过的吧？如果前几次还能做出来结果，但现在却做不出来，就一定是转膜液的问题。我刚刚经历这样的过程。呵呵
  　　你的膜事先用甲醇泡过并用转膜液洗过吗？
  　　如果转膜没问题，只需要看MARKER就足够了，不需要再用丽春红染。
  　　实在不行，你可以让其他实验室的人（转膜非常好的）看着你做一次，就可以把问题解决了。
  　　别灰心，实验就是这样！！失败次数多，有用结果少！

• txwuyan (2014-1-25 16:06:32)

  我的转膜液都是新鲜配置的应该没有问题。转膜条件的确是实验室以前的，因为我的目的蛋白分子量和以前他们做的差不多，但细胞不一样（有影响吗？），膜事先用100%的甲醇泡10秒快速激活后用转膜液浸10分钟以上。立春红染膜，蛋白和Marker是能看到的，但是Marker不是很清楚。而且整张PVDF膜都是红色的背景，不容易用水洗尽。别人建议不用染膜，而用预染的Marker就会好点。请问这样可行？

• 49888 (2014-1-25 16:08:23)

  我用的就是PVDF膜，立春红染色没问题阿。
  我处理膜的方法是在甲醇里泡一分钟左右（15秒也泡过，关系不大），然后在转移缓冲液里过几遍就好了。
  立春红染色时，如果是回收的立春红，有的时候因为纯度不高，染色时间要十分钟左右才有条带，如果是新的，3－5分钟就出来了，
  我现在都不需要染色了，转完膜之后直接就能看见膜上的条带，顺便再问一句，你的上样量够不？
  

• utt0989 (2014-1-25 16:08:41)

  我的上样量是40ug。立春红染色对后面的实验没有影响吗？是不是我的转膜时间不够？（我的蛋白是17 23 26 ，100V，90分钟，PVDF膜0.22um）。

• 49888 (2014-1-25 16:10:16)

  
  我的上样量也是40ug，之前做的蛋白也有17的，我是半干转，0.8MA/CM2，45分钟，染色后对后面的没影响，尽量洗干净，实在洗不掉的立春红放在封闭液里摇两个小时也摇掉了

• xingyi08 (2014-1-25 16:10:31)

  
  上了抗体了吗？目的条带能不能显影？

• zhenxin (2014-1-25 16:11:07)

  
  转膜肯定是没有问题了，我们实验室也是用的100v，60min电转，都没有什么问题的。我们只有觉得电转可能出问题的时候才会用丽春红染色的，通常用丽春红染十五秒左右，再用双蒸水洗，就能够看到清楚的蛋白条带，你估计是染的时间太长了，所以背景很红，而且不容易洗掉。另外，用pre-stained的蛋白Marker不就可以了，转膜完Marker很清楚的，不知道你用的是什么Marker

• eric930 (2014-1-25 16:15:35)

  
  我做了好多次WESTERN,是做CALCINEURIN，抗体是SIGMA公司的，代号是C0581,按照1:6000稀释，二抗是0168，1:2000稀释，但是就是做不出来，请教大家，有做出来的吗，能不能告知一下，谢谢！

• glass (2014-1-25 16:15:59)

  
  转膜是恒流吧，我们做分子量是65、72、160的蛋白都是是300mA两个小时，效果很好的~

• is2011 (2014-1-25 16:16:18)

  
  转膜需要恒流

• superboy (2014-1-25 16:16:36)

  
  PVDF膜用考马斯亮蓝染液染色5min，用脱色液（同脱PAGE胶的）脱色，一般来说2-3min就没问题了。不影响抗体的杂交。
  我一直这样做，效果不错。

• txwuyan (2014-1-25 16:17:31)

  
  我的目的蛋白分子量范围是17 19 23 26 ，之前Marker选用Fermantas的，考虑经费以及它的预染Marker很贵，只能选择非预染的。转完膜后，如果不染色看不到蛋白条带啊（“bluesky1987”）？而且如果立春红染膜时间短，又染不上，染上了整个PVDF膜就通红，很难用蒸馏水洗净。
  怎么解决啊？请战友们多提宝贵意见