冷冻电镜电子晶体学
电子晶体学
X-ray晶体学与生物电镜的结合形成电子晶体学，综合了三维密度图和傅立叶变换数学理论，这可追述到D.De Rosier和A.Klug对T4噬菌体尾部的螺旋结构的研究工作上[2]。通过获得已制好的结构规则的二维晶体的高分辨率电子密度图，我们可以解析出它的原子水平结构，螺旋对称样品或二十面体对称的病毒结构可用此方法获得高分辨率的结构。到目前为止。电子晶体学仍只能对二维晶体样品的结构研究达到原子或接近原子的分辨率水平，要利用电子显微学方法测定蛋白质的结构，首先必须得到在二维方向上高度有序且足够大的蛋白质二维晶体。二维晶体的三维傅立叶变换在倒易空间中表现为一系列的衍射点,晶体的结构信息就存在于这些衍射点中。晶体结构因子的振幅可直接从电子衍射谱测出,而相位可以从电子显微像的傅立叶变换得到,将两者整合并进行逆傅立叶变换就获得了晶体相应投影方向的结构密度图。其三维重构则是通过倾转样品,拍摄不同转角下的电子衍射谱和电子显微像,获取不同转角下的振幅和相位信息,最后将这些信息在三维倒易空间中拟合,并加入相应的晶体学对称,通过逆傅立叶变换得到实空间的晶体结构。
自从D.De Rosier和A.Klug于1968年第一次用该技术重构出Ｔ4噬菌体尾部的三维空间结构以来[2],共有4种膜蛋白的原子分辨率的结构通过电子晶体学方法确定下来,即细菌视紫红质(bacreriorhodopsin)[18]、植物捕获光能复合体Ⅱ (plant light narvesting complexⅡ)、水通道(aquaporin)和乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor)。还有一些膜蛋白得到了0.4~0.9nm分辨率的三维结构,如视紫红质(rhodopsin)、植物光系统ＩＩ反应中心(plant photo systemⅡ reaction centre)、H+ATP酶、微体谷胱转移酶(microsomeal glutathion transferase)、蛋白转运通道(SecYEG)、间隙连接子(gap junction)及Ｎａ+ Ｈ+转运蛋白(NhaA)等。还有一些水溶性蛋白,如微管蛋白(tubulin)也通过电子晶体学的方法得到了高分辨率(0.35nm)的三维结构。另外一大批膜蛋白或水溶性蛋白获得了1～2nm低分辨率的结构。以上高分辨率的结构都是以片状的二维晶体为对象解析出来的。但有一些蛋白并不形成这种片状的二维晶体,而是形成螺旋对称的管状晶体,如肌质网钙ＡＴＰ酶及乙酰胆碱受体等。另有一些蛋白在体内就以螺旋对称的纤维形式存在,如肌动蛋白及一些病毒粒子(如烟草花叶病毒)。这类呈螺旋对称的结构其优势在于一张照片中包含了各个角度的蛋白像,因此不需要倾转样品,在数据收集上相对简单。而缺点就是含有的晶胞数较少、信噪比低,分辨率没有典型的二维晶体高,至今最高分辨率是乙酰胆碱受体0. 40ｎｍ分辨率的三维结构。
电子晶体学一个不可比拟的优势在于通过这种方法得到的是膜蛋白和膜相关的水溶性蛋白在膜环境中的结构信息,和Ｘ射线晶体学相比更反映生理状态下的真实结构。下面,我们将以植物的光系统Ⅱ捕光叶绿素a/b蛋白复合体为例说明电子晶体学研究的优势。植物的光系统Ⅱ捕光叶绿素a/b蛋白复合体(LHCⅡ)是高等植物及绿藻体叶绿体中类囊体膜上含量最多的整合型膜蛋白复合体,它最重要的生物学功能是吸收光能并传递到光反应中心,这是光合作用的第一阶段。解析LHCⅡ的结构对于从本质上探索光合作用的过程和机理具有非常重要的意义。到目前为止,还没有植物LHCⅡ的三维结晶化及结构解析的报道,对于该结构解析最好的结果来自于电子晶体学。Kuhlbrand等人从豌豆的叶绿体中分离纯化了LHCⅡ,采用重组脂双层法得到了大面积的高度有序的LHCⅡ的二维晶体。通过对冷冻样品的电子晶体学分析得到了0.34ｎｍ分辨率的原子模型,此分辨率下的模型可提供大量的原子间位置关系和相互作用的信息,能帮助人们了解这个蛋白复合体光能吸收和能量传递的机制。
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