ELISA快速法检测HBsAg时手工洗板和洗板机洗板的结果比较
乙型肝炎病毒采用ELISA检测法具有操作简便、灵敏度高、试剂成本低、环保和适用于大批量人群抗原、抗体筛查等优点,目前在国内实验室被广泛使用[1]。但在操作中影响结果的因素也很多, 涉及标本的收集、保存、试剂准备、加样、温育、洗板、显色、比色、结果判断和结果报告及解释等方面,尤其洗板是一项极重要的环节, 洗板次数不够或洗涤不干净会造成假阳性的出现。在实验室中,ELISA 测定的洗板方式一般有2种,即手工洗板和洗板机洗板。本文就手工洗板和洗板机洗板对检测结果的影响进行了分析,现报道如下:
1 材料与方法
1.1 材料
酶标试剂:上海实业科华生物技术有限公司生产。阴性血清标本:50份经放射免疫法确诊为乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阴性的非脂血,无溶血的健康成年人外周血标本分离后的血清为检测对象,由辽宁省中医药大学附属医院临床检验中心提供。
1.2 方法
按试剂说明要求进行检测,分别用手工洗板,洗板机1～5次洗板后由酶标仪判读结果,对阴性数、阳性数、假阳性率进行分析。
2 结果
50份阴性血清标本分别经手工洗板,洗板机1～5次洗板后,经酶标仪判读结果。见表1。
表1 50份阴性标本的检测结果
3 讨论
在酶联免疫吸附试验中,洗板是非常重要的过程。ELISA是通过洗涤来达到分离游离和结合的酶标记物的目的,通过洗涤以清除残留在微孔板中未能与固相抗原或抗体相结合的物质,以及在反应过程中的非特异性吸附于固相载体上的干扰物质。聚苯乙烯对蛋白质的吸附是普遍的,在ELISA测定的反应过程中应尽量避免非特异性吸附,洗涤时应将这些非特异性吸附的干扰物质洗掉[2]。ELISA快速法检测血清中HBsAg(双抗体夹心法),如果洗涤不充分,残留在微孔板上的酶标抗体中的酶会使后来加的无色底物液变成有色产物,产生了非特异性显色反应,出现假阳性的结果。因此,洗板是最主要的关键技术,应引起操作者的高度重视。
在实验室中, ELISA 测定的洗板方式一般有2种,即手工洗板和洗板机洗板。手工洗板是每次反应温育后,将反应液吸出或甩干,然后在板孔中加满洗液,放置2～3 min后,将洗液吸出或甩干再在吸水纸上拍干。重复上述洗涤步骤3～4次,最后在吸水纸上拍干即可[3]。手工洗板人为因素比较大,实验人员必须经验丰富,洗涤次数要足够,冲击力又不要太大,加入的洗液量以刚满反应孔为限,防止孔口内有游离酶未能洗净,同时防止孔与孔之间液体交叉。洗涤结束后扣干亦非常重要,否则易造成假阳性。每次洗完板后,在吸水纸上轻轻拍干,拍板时要垂直,避免交叉污染,用力不能过猛,防止抗原抗体复合物脱离[4];吸水纸要一次性使用,应使用不易脱落碎屑的吸水纸为宜。酶结合物不耐干燥,特别在较高的温度下更易失活,所以拍干的反应板应尽量缩短在空气中暴露的时间,时间越长,吸光度值越低[5]。本实验中手工洗板未出现假阳性结果,因为笔者是严格按照试剂说明书的要求进行操作的。
洗板机洗板是将手工操作改由洗板机进行,人为因素少,速度快,条件恒定,但是使用洗板机洗板的一个特点是,每次洗板后不能拍干,故有较多的液体残留,需增加洗板次数来减少这种误差。洗板机洗板次数越少,假阳性越高,本实验中,洗板1次,假阳性率高达90%;洗板2次,假阳性率为38%;洗板3次,假阳性率为2%;洗板4～5次,未出现假阳性。洗板次数并非越多越好,太多不但浪费人力、物力,并且也会导致假阴性结果,所以一般试剂盒要求洗板4～5次即可[6]。洗板机洗板时应经常检查冲洗头是否通畅,若被杂物堵塞时可用注射器针头挑出。为了洗涤效果较好,实验室可采用机器与人工洗涤相结合的方法,在机器洗涤后再进行人工洗板1～2次,能达到理想的洗涤效果[7]。
综上所述,在ELISA快速法检验中,手工法洗板和洗板机洗板没有本质的差别,只要操作合乎要求,均能得到正确、可靠的结果。
