有丝分裂（Feulgen染色）制片技术
实验概要
1、通过本实验的学习，初步掌握植物染色体制片，奠定细胞遗传学研究的基本技术；
2、通过对植物根尖细胞的观察，掌握有丝分裂过程中染色体的形态特征和动态变化；
3、掌握Feulgen染色方法。
实验原理
有丝分裂（mitosis）是植物细胞分裂的主要方式，细胞分裂过程中，核内染色体准确地复制，并有规律地、均匀地分配到两个子细胞中去，保证了植物细胞的遗传性状的一致。各种生长旺盛的植物组织中，如根尖组织、茎尖组织、居间分生组织、愈伤组织等，每天都有分裂高锋时间，此时经预处理，固定、解离、染色和涂抹压片等方法，在显微镜下可以观察到处于有丝分裂各时期的细胞和染色体。
孚尔根染色法是鉴别细胞中DNA反应的组织化学方法。细胞内的DNA(通常位于核及染色体上)在1N HCl 60℃水解时部分地破坏了脱氧核糖与嘌呤碱之间的糖苷键而使嘌呤碱脱掉，从而使脱氧核糖的第一个碳原子上潜在的醛基获得了自由状态。而无色的亚硫酸品红是由偏重亚硫酸钠、盐酸和碱性品红配制成的。偏重亚硫酸钠与盐酸能产生亚硫酸根，当具有醌式结构的碱性品红分子与亚硫酸根结合后，醌式结构的共轭双键被打开，碱性品红变为无色。当用这种无色的亚硫酸品红去染经酸解的细胞时，就会与染色体DNA上游离的醛基结合，又出现了呈现红色的醌式结构，从而使DNA分子着色。这一反应是1924年由Feulgen 和Rossonbek 所发现和确定的，已广泛用作鉴别DNA的一种特异性检查方法。
主要试剂
卡诺氏固定液（冰醋酸:无水酒精=1:3）、秋水仙碱（或8－羟基喹啉）、无水乙醇、1N HCl、 45醋酸、0.2秋水仙素、碱性品红、偏重亚硫酸钠（钾）
Schiff试剂的配制
Schiff试剂：即脱色亚硫酸品红。溶解1g碱性品红于200ml 煮沸的重蒸馏水中，轻加摇动。继续煮5分钟使之完全溶解，冷却至50-55℃时过滤到棕色试剂瓶中，冷却至25℃时，加入20ml 1N HCl和1-3g偏重亚硫酸钾(K2S2O5)或偏亚硫酸钠(Na2S2O3)。摇动使溶解，密闭瓶口置黑暗低温处或冰箱内(4℃左右)18-24h后检查。溶液呈无色透明或淡黄色即可。如有不同程度的红色，可加入0.5-1g活性炭，激烈震荡1分钟，仍在低温下静止1小时或过夜。然后用粗滤纸迅速过滤后使用。密封瓶口，包以黑纸，在0-5℃可以保存5-6个月。
偏重亚硫酸钾(K2S2O5)或偏亚硫酸钠(Na2S2O3)与1N HCl反应，放出SO2、 SO2与碱性品红反应生成碱性品红 —— 亚硫酸溶液，呈无色。
漂染液的配制
取10%亚硫酸钠10 ml，加200 ml蒸馏水，再加10 ml1N HCl即可。
主要设备
水浴锅(60℃水浴)、显微镜、培养箱、电子天平、酒精灯、100℃温度计、具塞试管、吸管、滤纸条等。
实验材料
蚕豆（Vicia faba, 2n=12）（或其它植物）干种子；洋葱（Allium cepa, 2n=16）根尖。
实验步骤
1、材料准备
（1）、蚕豆根尖：选取新鲜无病斑的蚕豆干种子，经日晒后，放在烧杯内，室温下清水浸泡一昼夜。种子吸水膨胀后， 20℃左右保湿培养（双层纱布覆盖），待根长1－2cm时，于上午9:00－10:30或下午14:00－16:00剪下根尖备用。
（2）、洋葱根尖：通过休眠的洋葱鳞茎，经日晒后，置于盛有清水的小烧杯上，根部与水接触，20－25℃光照条件下培养2－3天，待根长1－2cm时，于上午9:00－11:00剪下根尖备用。
2、预处理
为获得较多中期分裂相的细胞，且使染色体缩短和分散，可对根尖进行预处理，方法如下（取其一即可）：
（1）、0.05％－0.2％的秋水仙碱水溶液处理2－4小时；
（2）、0.002M的8－羟基喹啉溶液处理3－4小时；
(3)、根尖浸在蒸馏水中于在1－4℃低温下处理24小时。
3、固定
用蒸馏水洗净材料，再用卡诺氏固定液（冰醋酸:无水酒精=1:3）（用量应为材料体积的15倍以上）室温下固定30－60分钟。固定的材料如暂不制片，可经90％酒精→80％酒精→70％酒精（各半小时）浸泡进行转换，最后置于70％酒精内放入0－4℃冰箱，约可保存半年。如保存时间太长，需重新固定后再用。
4、Feulgen染色法
(1)、取经预处理并固定好的洋葱根尖，用水洗2-3分钟，放入室温条件下的1N Hcl处理根尖材料2-3分钟。
（2）、将根尖换入60℃预热的HCl，置于恒温水浴中，在600.5℃的条件下水解8-10分钟。
（3）、吸出热HCl，换入室温1N HCl再处理1-2分钟，然后水洗2-3次。
（4）、吸净水分，加入Schiff试剂，盖上盖子，在黑暗条件下染色至少30分钟，也可过夜。
（5）、漂染液冲洗三次，每次至少5分钟去、去掉细胞中残存的品红分子。
（6）流水冲洗10-15分钟，再用蒸馏水冲洗并放于蒸馏水中待用。
（6）、取根尖（紫红色部分）置载玻片上，用镊子夹碎后，加一滴45醋酸，盖上盖片、压片。
（每组另做未经HCl处理的为对照）
5、显微观察：
制备好的细胞学片子，置于显微镜上，先用低倍镜（10×10）寻找具有分裂相的细胞，再转换到高倍镜（10×40）下观察。
注意事项
影响孚尔根（Feulgen）反应的主要因素
(1)水解时间和温度：
这是实验的主要关键。水解适当时，染色体着色较深而细胞质不显颜色，水解不足，染色体着色浅淡，细胞质中可能有其他醛基存在而显示扩散的红色。水解过度，则染色体着色不匀，这是由于DNA解聚而产生的游离核酸分子从染色体扩散到细胞质中，使细胞普遍着色。随着时间的过度，会使水解液中的反应增强，而细胞不能着色。
(2)固定液的成分：
不同成分的固定液常出现不同的颜色反应。含铬酸的固定液产生红色，酒精-醋酸固定液产生红色、紫红色，只用酒精的呈现紫色，用含甲醛的固定液则呈现强烈的紫红色。当需要对染色体中的DNA
定量测量时，一般只能用不含金属离子和甲醛的固定液，如酒精-醋酸固定液等。
(3)SO2含量： Schiff试剂中的SO2含量也影响孚尔根反应的颜色表现。SO2含量低时呈红色，含量高时则偏向蓝色。
(4)染色质中DNA的含量：
供试材料的染色质中DNA含量的不同是影响显色反应强度的根本因素。不同生物和不同的组织、细胞中DNA含量不同，显色强度也各异，并且二者之间是正相关的。实践证明，具有大、中型染色体的材料，如百合科及部分禾本科植物材料，适于用孚尔根反应，小型染色体的材料特别是玉米、水稻等不适于用孚尔根法染色。
