基因组文库法
基因组文库法
一）基因组DNA分离、纯化和加工
[Mbo I酶检测]
1．准备1.5ml小试管4个；每管内含有：
基因组DNA（在TE或水中） 10.0μg
10×Mbo I缓冲液 2.5μl
H2O 12.0μl
2．向每管中分别加入：0.1，0.5，1或2单位的Mbo I酶。
3．37℃保温到5，10，20，40分钟后，分别从每管中移出6μl，在干冰中贮存到下一步时一并使用。
4．把16个样品在琼脂糖凝胶中进行电泳，并与标准分子量进行比较。
5．选择参数为：能产生平均大小约20kb的时间和Mbo I的浓度。
[Mbo I酶切]
1．根据上述酶切检测结果，选用最佳酶切条件，并把酶的量加大100倍，用以消化1mg的基因组DNA；取1个10~15ml的塑料管，加入：
含1mg基因组DNA 1.0ml
Mbo I 按所测定的量加
10×Mbo I缓冲液 250.0μl
H2O 1.2ml
按前述（5）中所测定出的时间（产生20kb）于37℃保温。
2．用2.5ml 1：1酚和氯仿混合物抽提DNA.
3．把上层水相移入一新管中，加275μl 5M的NaCl。
4．加7ml乙醇，置冰水浴中沉淀10分钟。
5．4℃，12 000g离心10分钟。
6．倒除乙醇，重悬DNA于500μl TE缓冲液中，重悬过程在4℃中需数小时。
7．为获得大小合适的DNA片段，将步骤6中的DNA分作6分（每分约80μl），分别放在含蔗糖梯度密度Beckman Ultra-clear SW41超离心管中，各通过蔗糖梯度密度仪。在含10~40%的蔗糖，20 mM Tris（pH7.4），10mM EDTA，1M NaCl等浓度中形成线性梯度。
8．135 000g 20℃离心16小时。
次日
9．用粗针头在每一管的底部刺一小孔（依次收集6管中的DNA）每管按12滴（350~500μl）作为一分收集入a, b, c…数管中，然后再收集第二管、第三管等依次并入a, b, c各管中。
10． 从每分中都取10μl样品加10μl水稀释、4μl载样缓冲液、用0.4%琼脂糖凝胶电泳，然后与Hind Ⅲ酶切的λDNA标准分子量作比较，以确定那一分中所含片段为10~20kb大小。
11． 将含有16~20kb片段的管子并在一起，加2.5倍体积的乙醇，-20℃冷冻数小时。
第三天
12．10 000g 4℃离心10分钟，收集DNA。
13．弃上清液，重悬于160μl TE缓冲液中。
14．对大小合适的片段（16~20kb）再按8~13重复梯度分离，但此次只用两个管子即可；每管中各用80μl DNA。第二次蔗糖梯度分离后，将沉淀的DNA悬浮在50μl TE缓冲液中。
第四天
15．取2.5μl样品（用溴化乙锭染色），与已知浓度和片段大小的DNA片段在琼脂糖凝胶中电泳后，比较两者染色强度，估算出DNA浓度，并确证所制备出插入片段的不同大小。
16．把样品DNA浓度调到0.25μl/ml，-20℃贮存备用。
二）用于基因克隆载体DNA（噬菌体DNA）的制备
1. 用BamH I酶切EMBL3 DNA，加：
EBML3 DNA(500μg) 500μl
10×BamH I缓冲液 100μl
BamH I (10U/μl) 100μl
H2O 300μl
2. 于37℃保温2小时。
3. 每管中加1体积（500μl）SS-酚和氯仿（1：1）混合物。充分混匀，于微型离心机中离心2分钟以分离两相，吸取上清水相至新管。
4. 在每管中加500μl氯仿，充分混匀，离心2分钟，分相。
5. 吸水相转入新管。
6. 在各试管中加50μl 5M NaCl，再加1ml乙醇。冰水浴中冷却10分钟。
7. 在微型离心机中4℃离心5分钟。
8. 弃去上清液，加1ml 80%乙醇洗涤沉淀物，离心弃去液体。
9. DNA沉淀物真空干燥。
10. 用500μl TE缓冲液溶解沉淀物。
11. EcoR I酶切EBML3 DNA，加：
从步骤10中所获DNA 500μl
10×EcoR I缓冲液 100μl
EcoR I (1 000U) 100μl
H2O 300μl
12. 于37℃保温4小时。
13. 按3-9抽提、沉淀并回收。
14. 用500μl TE缓冲液溶解沉淀物。
15. 异丙醇沉淀：在步骤14中得到的500μl DNA于1.5ml离心管中加：3M 醋酸钠（pH6.0）75μl，异丙醇（在1.5ml微型离心管中）300μl。
16. 冰水浴中置15分钟。
17. 在微型离心机中4℃离心10分钟。
18. 弃上清液，用200μl 0.35M醋酸钠和乙醇（1：2.5）溶液洗涤沉淀物。
19. 在微型离心机中4℃离心10分钟。
20. 重复步骤18和19。
21. 弃去上清液，真空干燥沉淀物。
22. 以0.5μg/μl浓度溶解于TE缓冲液中。
23. -20℃保存备用。
三）基因组DNA和载体噬菌体DNA的连接和包装
1．可按下列步骤在5个1.5ml的小离心管中（用笔标记上从A到E）加入下列试剂：10×连接酶缓冲液1.0μl，载体臂DNA（0.5μg/μl）2.0μl。
2．再往每管中加：
A | B | C | D | E | |
Mbo I插入片段（0.25μg/μl） | - | 1μl | 2μl | 3μl | 4μl |
H2O | 6μl | 5μl | 4μl | 3μl | 2μl |
T4 DNA连接酶 | 1μl | 1μl | 1μl | 1μl | 1μl |
每管总量10μl |
3. 令其充分混合，离心，于14℃保温12~16小时，连接物可在-20℃下保存备用。
4. 包装方法：为简便起见，可购买包装抽提物。各管子中的10μl连接液都用于包装，按产品说明书进行操作。包括将连接物和包装抽提液混合，然后22℃保温2小时。
5. 包装混合液用TMG缓冲液稀释至250μl，包装后的DNA于4℃保存，切勿冷冻。
6. 取等分稀释液，倒平板，确定建库的最适比例；然后按最适比例一系列连接和包装反应，再合并。构建文库要测效价和倒平板，以便供筛选和扩增之用。
四） 测效价和制备文库平板
1．取500ml消毒培养瓶，注入100ml消毒LB培养液，再接种入2ml含有新鲜LE392细菌的麦芽糖液，培养至OD600近1.0。
2．收集细胞分别于两个带螺旋帽50ml聚苯乙烯管中；2500g离心10分钟。
3．弃上清，把每一沉淀物重悬入25ml消毒的10mM MgSO4中。
4．LE392细胞在4℃中可存两周；贮存过长会降低接种存活率。
5．接种噬菌体和测效价：从每250μl包装反应液中取1μl（从前（三）中5），加入到99μl TMG中，分1μl和10μl此稀释液加入13mm（直径）×100mm（长）消毒管中；同时也稀释和铺制克隆载体平板、连接和包装，但无插入（三种A管），作为本底对照。
6．从4步骤向每管中加200μl LE392细菌，混匀，室温孵育20分钟。
7．加2.5ml含有10 mM MgSO4的上层琼脂（48℃）；在室温中把每管立即倒入琼脂平板上，旋动，令上层琼质分散均匀。
8．室温中置5分钟，令琼脂变硬，反置平板，37℃中培养8~16小时，当LE392细胞长满后，由于溶菌作用，空斑形成将非常明显。
9．计算每一包装反应效价，统计每一平板空斑数，理想浓度的插入片段的效价应是：如建立文库成功，与无插入对照文库相比，至少大5~10倍。
10． 放大：如需放大，应用足够反应样品去建库，在最适条件下重复连接和包装反应，但不扩大反应规模；对哺乳动物基因组，理想的目标文库大小是1~2×106噬菌斑，合并包装混合物，并通过倒平板计算噬菌斑数，用来测定其效价，或文库的含量。
11． 以下7个步骤是倒平板供文库筛选，如果筛选前要扩增文库，则可按六、文库扩增法进行，然后再回到步骤12。
12． 文库倒平板筛选：要筛选5×105~106噬菌斑，一般每个90mm LB琼脂平板上有104噬菌体；先取20ml LE392细胞；装入50ml无菌带帽塑料试管中，在细菌中加入已知效价的包装混合液5×105~106噬菌斑，混合。
13． 室温中置20分钟，令噬菌体附到细胞上。
14． 在50~100个13×100mm的无菌玻璃试管中各加200μl受吸附的细菌。
15． 室温下每管各加2.5ml 48℃融化的无菌LB上层琼脂糖，并立即倒在LB琼脂平板上，摇动使之分布均匀，连续倒完全部平板。
16． 室温下置15分钟，使上层琼脂糖凝固，于37℃倒置培养8~16小时。
17． 此间将出现噬菌斑。
18． 4℃保存平板。
