CRISPR触发的内源Oct4或Sox2基因位点染色质重塑激活细胞重编程

题目：CRISPR-Based Chromatin Remodeling of the Endogenous Oct4 or Sox2 Locus Enables

Reprogramming to Pluripotency

期刊：Cell stem cell

影响因子：23.394

主要技术：CRISPR-dCas9-VP64激活系统、诱导性多能干细胞构建、原代细胞制作、iPS鉴定

研究背景

终末分化的成体细胞逆分化，形成多能干细胞状态的过程称为细胞重编程（Cell reprogramming）。在2006年，日本科学家山中伸弥（Shinya Yamanaka）发表诱导性多能干细胞（iPS, induced pluripotent stem cells）构建技术，利用逆转录病毒，把OSKM（OCT4, SOX2,KLF4 and C-myc）四因子在体细胞中进行超表达，成功把小鼠胚胎成纤维细胞诱导形成多能干细胞，开辟了一个全新的干细胞研究领域。随着研究的深入，人皮肤成纤维细胞、T淋巴细胞等也被成功诱导成多能干细胞。而这些多能干细胞与供体DNA是保持一致的，且有分化成多种细胞的潜力，展现出非常广阔的临床应用前景。如把人血液中的T淋巴细胞逆分化形成多能干细胞后，当定向分化技术成熟时， iPS能被有序分化成需要的细胞，比如心肌细胞、神经细胞等。

染色体上重要的基因启动子位点的表观遗传学变化，如DNA甲基化水平变化、组蛋白乙酰化水平变化、染色质重塑等，开启重要基因如OCT4, SOX2等的内源性表达，是iPS诱导过程中至关重要的事件，直接关系到诱导是否成功。

CRISPR-Cas9系统作为一种强大的基因编辑工具，现今已广泛用于常规的细胞或者个体的基因敲除、基因敲入、点突变外。当CAS9蛋白进行失活改造以及结构域添加后，得到CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系统，则能实现特异基因转录激活。CRISPR-dCas9内源基因激活技术（SunTag Gene Activation），正好与iPS诱导技术完美契合，解决了激活内源OSKM四基因的问题，从而诞生了新型的iPS构建策略（见图1）。

图1. 利用CRIPR-dCas9基因激活系统的iPS诱导策略                 

研究内容及结果

1. 设计定位于Sox2和Oct4基因启动子区和Oct4增强子区的sgRNA，利用CRISPR-dCas9-SunTag-VP64对Sox2和Oct4进行激活。

本研究首先设计了相应基因靶标的SgRNA，启动子区或者增强子区靶标位置考虑因素包括：sgRNA靶标位置与重要的转录因子（OCT4、SOX2、NANOG）结合位点、组蛋白乙酰转移酶p300结合位点的距离，靶标区附近组蛋白乙酰化分布、DNA甲基化分布等。并以MEF细胞为材料，在RNA水平检测了不同sgRNA对靶标基因sox2和oct4的激活效果（图2）。
                

图 2. MEF细胞中，Sox2和Oct4基因启动子区和Oct4增强子区不同sgRNA的转录激活效果验证实验

2. CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系统对重要基因进行内源激活，能成功获得iPS。

随后，同样使用此方法，利用筛选出来18个有效sgRNA，分别激活7个重要基因: Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nr5a2, Glis 1, Cebpa。将MEF利用病毒感染方法进行18 sgRNA导入后，与dCas9-SunTag-VP64形成复合体，激活了OG2-MEF中相应内源基因的表达，经过17天的诱导后，成功得到了iPS细胞，并稳定传代，且显示出与胚胎干细胞相同的克隆形态。通过免疫荧光和QPCR，显示得到的iPS表达Nanog, Sox2和SSEA-1，相关干细胞基因表达水平与RI胚胎干细胞相比，均相当或者超过。此部分证明CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系统进行内源激活时，能成功实现iPS诱导（图3）。
 

图3. CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系统同时激活Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nr5a2, Glis 1, Cebpa内源表达时，能成功实现iPS诱导