一种利用表面等离子共振定量流感病毒的新方法...（二）

材料和方法

    对照血清(绵羊)和病毒抗原购自英国NIBSC，除了B/Brisbane/3/2007血清和抗原来自荷兰Solvay Phormaceuticols，PR/B/34血清(鸡)和病毒是购自美国Charles River Laboratories。重组的全长HA蛋白(A/H1N1/New Caledonia/2O/99、A/H3N2/Wyaming/3/2003和B/Jilin/20/2003)分别购自以色列PraspecBio、荷兰Genway和美国Protein Sciences。表4中分析的工艺样品来自瑞典通用电气医疗集团，除了B/Brisbane/3/2007 MBV和TBV)样品以及A/H1N1/Salamon Islands/3/200 TBV样品是由荷兰Solvay Pharmaceuticals提供的。三价疫苗购自三家制造商。覆面活性剂P2O(polyoxyethglenesorbitan)、HBS-EP+缓冲液(10 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05％表面活性剂P2O)、氨基偶联试剂盒、Cy3-染料、琼脂糖和DNA均来自通用电气医疗集团。牛血清白蛋白(BSA)购自Pierce，DMEM购自Invitrogen，蔗糖、NaCl和两性洗涤剂Zwittergent购自默克。

    所有分析都使用了Biacore TM l00系统和CMS传感器芯片(通用电气医疗集团)。相互作用研究是基于金表面的表面等离子共振检测，再结合处理试剂的微流体系统。生物分子之间的相互作用以非标记分析形式实时监控。相互作用分子中的一方固定在传感器表面的半流体葡聚糖基质上。另一个分子随后注入到流经传感器表面的溶液中。当注入样品中的分子与固定在传感器表面的相互作用配体结合时，即可检测到SPR响应的变化。响应水平的变化与表面上质量的变化成正比。此方法设定为抑制分析(图1)，以避免大的病毒分子的扩散影响[28]。样品无需预处理就能分析。HBS-EP+作为分析缓冲液。采用标准的胺偶联步骤[29]，注入50-80 ul重组HA(10 ug/ml)从而将重组HA蛋白固定在7000-10000个响应单位(RU)，条件分别为l0 mM马来酸缓冲液(含0.05％Surfactant P2O,pH 6.5)(HA/H1Nl l5分钟,HA/H3N2 7分钟),或者在10 mM磷酸缓冲液(含0.05％Surfactant P2O,pH 7.0)。(HA/B 20分钟)。

    对抗流感血清进行滴定，以在400s注射时间内在各自对应的表面上产生700-l400个RU的响应。将病毒参照抗原混合物，或未知浓度的病度样品，与固定稀释度的抗流感血清混合，在400s内注入表面。随后利用50 mM HCl、或者0.05％Surfactant P2O再生表面(30s)。注射样品中的游离抗体与表面的HA结合。产生响应(图1)。每次分析时先进行5-10次只有血清和再生步骤的启动循环，以稳定表面。在每次分析开始、中间和结束时均分析血清和参照抗原的校准曲线。为了在分析过程中根据校准曲线的改变而调整，将三个校准曲线中的四个参数回归的换算系数用于生物传感器软件的原型功能性的标准化。因此每个样品得到一组独特的校准曲线系数，用于样品浓度的计算。

    在微滴定板中制备标准品和样品，样品体积40-80 ul，分析一股以无人值守的模式过夜运行(96个样品/标准品约15个小时)。

    可靠性测试所使用的添加剂为DNA、BSA、DMEM、蔗糖和NaCl，如表3所示。

    在三价分析中，HAA/H1Nl、A/H3N2和B固定在同一块芯片的三个不同通道中(图7)。首先将三个特定的参照抗原与血清(A/H1N1/Solomo Islands、A/H3N2/Wiscansin、B/Malaysia)混合，以形成三价的校准曲线抗原和三价血清。样品随后穿过三个表面，在一个实验中同时分析三个毒株。

按照制造商所提供的SRID滴度按比例稀释血清亚型特异性研究，以评估血清亲和力的差异。

图1. 抑制分析的原理(A和B)。一开始将HA固定在葡聚糖基质上(黑色实心圈)。病毒随后与固定浓度的血清混合，并注射到表面。游离的抗体(在平衡的不与病毒结合)与表面HA结合，产生响应。样品中低浓度的病毒(A)产生高的抗体结合，而高病毒浓度(B)产生低的结合水平。(C)叠加图显示出注射的血清与系列浓度的病毒标准品混合后的感应图。在注射前后取报告点(标以X)，并测量这之间的响应水平(箭头所示)。每次注射后再生表面，为新注射作准备。