植物蛋白质组学中的双向电泳技术实验（四）

3.3 第二向：多重垂直 SDS-PAGE

SDS-PAGE 可以在水平或垂直系统上进行 [29] 。水平设备适用于预制胶（ExcelGel SDS；Amersham Biosciences/ GE Healthcare) 。而垂直系统则应用于多块胶平行进行的电泳中，尤其是大规模的蛋白质组分析中。这种分析通常需要同时进行数批第二向 SDS-PAGE 电泳以达到更高的通量和最好的重复性 [31] 。

1. 灌制 SDS 胶

( 1 ) 灌胶胶板（200 mm X 250 mm) 由两块书本形状的 3 mm 厚的玻璃板组成。两块玻璃板用一根铰链条连接，玻璃板之间有两条 1 mm 厚的边条。将 14 块胶板垂直堆入 Ettan Dah  II 的灌胶模具中。堆叠时铰链条朝右，胶板之间用塑料分隔片（如 0.05 mm 厚聚酯片）分隔。

( 2 ) 将灌胶模具的前板放好，旋上螺帽（用手拧紧）（图 13-2)。

( 3 ) 用环架将一个漏斗支撑在灌胶模具顶端上方约 30 cm 处，用一根聚乙烯管（内径 5 mm ) 与之连接。管的另一头与灌胶模具一边的侧室上的金属接口相连。

( 4 ) 向侧室中灌入 100 ml 指示剂。

( 5 ) 在即将灌胶之前，在凝胶溶液中加入 TEMED 和过硫酸氨溶液（表 13-5)。灌胶时，将凝胶溶液（830 ml) 注入漏斗。管中避免产生气泡。不要用丙烯酰胺溶液将胶板灌满。这是由于用热琼脂糖将 IPG 胶条固定在 SDS 胶顶端时需要一定的空间（约 10 mm)。

( 6 ) 当溶液注入之后，将管从侧室接口上取下。此时侧室中指示剂的水平面会下降。

( 7 ) 小心地向每块胶的顶端加入约 1 ml 覆盖液以使胶面平整光滑。

( 8 ) 让凝胶在约 20°C 聚合至少 3 h，为获得更好的重复性，最好过夜聚合。

( 9 ) 胶聚合后，将灌胶模具的前板取下，小心地从模具中取出胶板。可用刀片将胶板分开。将胶板之间的分隔片取下。

( 10 ) 用水清洗胶板以除去胶板外表面的丙烯酰胺，然后将多余液体从胶上端排出。由于电泳一次只能用掉 12 块胶板，应丢弃不理想的胶板，尤其是厚度不均匀的胶板。通常是外侧的胶板。

( 11 ) 如果聚合好的凝胶不被立即使用，可将它们用塑料包好贮存在冰箱中（4°C )。最长可贮存 2 天。

2. 使用 Ettan Dalt II 垂直电泳槽进行多重 SDS-PAGE

( 1 ) 向 Ettan Dalt II 电泳槽下槽中加入 1875 ml 电极缓冲液储液和 5625 ml 去离子水。混合并打开冷却器（25°C)。

( 2 ) 将 DALT 胶板（内有 SDS 凝胶）垂直放置在胶板架上以便放上 IPG 胶条。

( 3 ) 用电极缓冲液（用水 1 : 1 稀释）短暂冲洗平衡好的 IPG 胶 条，将胶条放在 DALT 胶板顶端。

a. 用薄刮刀或尺子推 IPG 胶条背后支持膜，使胶条进入两层玻璃板之间的空隙中。

b. 加入 2 ml 热（75°C ) 琼脂糖溶液，继续将胶条向下推向 SDS 胶表面直到两者紧密接触。IPG 胶条和 SDS 胶表面之间避免产生气泡。

c. 如需在电泳同时加入分子质量标准蛋白质，可用 5 μl 溶有 SDS 标准蛋白质的电极缓冲液浸泡一张滤纸片（2~4 mm2 ) 。弄干滤纸片后将其放在 IPG 胶条的左侧或右侧。

d. 干燥后的溶有分子质量标准蛋白质的滤纸片可放在微量离心管中贮存于 -70°C。

( 4 ) 在将胶板放入电泳设备（见第 5 步）之前让琼脂糖凝固至少 5 min。对剩余 IPG 胶条重复上述步骤。虽然将胶条埋入琼脂糖并不是必须的，但这样做能保证 IPG 胶条和 SDS 凝胶顶端结合更紧密。

( 5 ) 将胶板浸入电极缓冲液使其外侧湿润以便放入电泳槽时更容易。将胶板插入电泳槽中。如有必要，在电泳槽中空着的狭槽中放入空的胶板。将上槽穿过胶板放好，并在其中加入 2.5L 电极缓冲液（1250 ml 储液 + 1250 ml 去离子水) 。

( 6 ) 盖上电泳槽的安全盖，并开始 SDS-PAGE。开始时以每块胶 5 mA ( 设置最高 100V ) 跑大约 2 h。然后以每块胶 15 mA ( 设置最高 200V ) 过夜跑大约 16 h，或更高的电流以便跑得更快（每块胶 30 mA 大约 8 h)。

( 7 ) 当溴酚蓝踪迹迁移出凝胶下端后终止电泳。

( 8 ) 电泳结束后，小心地用塑料刮刀打开胶板。用刮刀将琼脂糖从聚丙烯酰胺凝胶上去除。小心地从玻璃板上剥下凝胶，拎着它的下缘将其放入装有固定液或染色液的盒子里。