（二）随机引物合成法

随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常，产物平均长度为400～600个，可以获得大量的有效探针。反应时对模板的要求不严格，用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。反应产物的比活性较高，可达4×109 cpm/μg探针。随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。
1. 材料

（1）设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。 　　

（2）试剂：①随机引物（随机六聚体或断裂的鲑鱼精子DNA）。 ②10×随机标记缓冲液：900mmol/L HEPES (pH6.6)；10mmol/L MgCl2。③Klenow片段。④20mmol/L DT。⑤未标记的dNTP溶液：dGTP、dCTP和dTTP溶液，各5mmol/L。⑥[α-32P] dATP：比活性3000Ci/mmol，10μCi/μl。 ⑦缓冲液A：50mmol/L Tris·Cl（pH7.5）、50mmol/L NaCl、5mmol/L EDTA（pH8.0）、0.5% SDS。

2.步骤

（1）200ng双链DNA(1μl)和7.5ng随机引物(1μl)混合后置于Eppendorf管内，水浴煮沸5min后，立即置于冰浴中1min。

（2）与此同时，尽快在一置于冰浴中的0.5ml Eppendorf管内混合下列化合物：20mmol/L DTT 1μl、未标记的dNTP溶液 1μl、10×随机标记缓冲液 1μl、[α-32P] dATP(比活性3000Ci/mmol；10μCi/μl) 3μl、ddH2O 1μl。

（3）将步骤(1) Eppendorf管中的溶液移到步骤（2）管中。

（4）加入5U(约1μl) Klenow片段，充分混合，在微型离心机中以12 000g离心1～2s，使所有溶液沉于试管底部，在室温下保温3～16h。

（5）在反应液中加入10μl缓冲液A后，将放射性标记的探针保存在-20℃下备用。同时计算放射比活性。 　　

3.注意事项

（1）引物与模板的比例应仔细调整，当引物高于模板时，反应产物比较短，但产物的累积较多；反之，则可获得较长片段的探针。

（2）模板DNA应是线性的，如为超螺旋DNA，则标记效率不足50%。

（三）光敏生物素标记方法

光敏生物素是一种化学合成的生物素衍生物。其分子中含有可光照活化的叠氨代硝苯基。醋酸盐易溶于水，在水溶液中光敏生物素醋酸盐与待标记核酸混合，在强可见光短暂照射下即能与核酸的碱基反应，生成光敏生物素标记核酸探针。一般在规定条件下，核酸中每100～150bp可结合一个生物素。这种生物素标记的探针不会影响探针序列与其互补和新的靶序列之间的杂交。该标记方法的优点是简便易行，单、双链DNA和RNA都能以此法标记形成稳定的共价结合，且生成的标记探针为橙红色，便于观察反应结果。此法标记的探针可检出0.5pg滤膜结合DNA。此外，标记探针稳定性好，-20℃可保存12个月。

1.材料

（1）仪器　LYQ 12～100卤钨灯、台式离心机。

（2）器皿　微量移液器、Tip头，光标用冰模、墨镜、尺子。

（3）试剂　①光敏生物素醋酸盐为白色干粉，分子量为533。在暗室中用灭菌双蒸水溶解，使成1mg/ml。小量分装，避光下-20℃可稳定保存4～6个月。②仲丁醇或正丁醇。③TE缓冲液100 mmol/L Tris·Cl(pH 9.0)1 mmol/L EDTA。④无水乙醇、70％乙醇。⑤3 mol/L醋酸钠(pH5.2)。⑥0.1 mmol/L EDTA(pH8.0)或灭菌dH2O。

2．方法

（1）强光源照射标记：在暗室安全灯下，向微量离心管中加入15μg待标记核酸(DNA或RNA)，15μg光敏生物素并混匀。将反应管敞口插入冰模中，液面距光源10cm，用LYQ 12-100卤钨灯光照标记30min。加入70μlTE缓冲液。此后操作在正常光线下进行。

（2）仲丁醇提取：加入100μl(等体积)仲丁醇(或正丁醇)，充分混匀，4000g离心2min。吸弃上相，加入等体积仲丁醇(或正丁醇)重复萃取一次。

（3）乙醇沉淀浓缩：吸弃上相，计量下相(溶液可浓缩至40μl左右)。加入1/10体积3mol/L的乙酸钠(pH5．2)和2倍体积冷无水乙醇，混匀。-20℃沉淀过夜或-70℃沉淀1h以上。以4℃10 000g离心15min。弃上清，再用100μl 70％冷乙醇以4℃ 10 000g离心15min。离心洗涤沉淀(注意勿将沉淀吹散)。

（4）标记核酸的保存：真空干燥或室温风干标记沉淀物，将其溶于适量0.1 mmol/L EDTA溶液或灭菌双蒸水中。适量分装后-20℃避光保存备用。