真菌菌丝的总RNA的提取方法

　　1.实验试剂

　　(1)RNA提取缓冲液(CTAB):2% CTAB(W/V),2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP(W/V),100mM Tris-HCl(pH8.0,DEPC处理的水配置),25mM EDTA,0.5g/L 亚精胺Spermidine,2.0M NaCl,2%巯基乙醇(V/V,使用前加入).由于在高温灭菌条件下,Tris-HCl要和DEPC发生反应,所以配RNA提取缓冲液时直接用DEPC 处理的水配制即可

　　(2)SSTE:1 M NaCl,0.5% SDS(W/V),10mM Tris-HCl pH8.0,1.0mM EDTA

　　(3)10M LiCl 直接用蒸馏水配10M LiCl,加1‰的DEPC过夜后,高温灭菌

　　(4)3M NaAc

　　(5)氯仿:异戊醇(24:1)

　　(6)酚(pH4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1)

　　(7)DEPC处理水 用1‰的DEPC处理蒸馏水过夜,高温灭菌

　　(8)无水乙醇；70%酒精

　　2.实验步骤

　　(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

　　(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀

　　(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次

　　(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

　　(5)取上清,等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

　　(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)

　　(7)10,000rpm,4℃离心20min

　　(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀

　　(9)酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提两次,氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

　　(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

　　(11)12,000rpm,4℃离心20 min

　　(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

　　(13)加200ul的DEPC处理水溶解

　　(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

　　(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)

　　注意:提取RNA请尽量在低温下操作,如果条件不容许,在室温下操作的时间要尽可能的短.