小鼠胚胎成纤维细胞MEF培养相关知识总结
小鼠胚胎成纤维细胞的富集
1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。
2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。将子宫角移到10cm的皿里。用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。
3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。
4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。
5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml胰蛋白酶/EDTA继续剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。
6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。
7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。将皿放回培养箱再孵育10分钟。
8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。
9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。每个培养瓶中装大约3个胚胎。
10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。
11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。
12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。
13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。
注释：
我们已用CF－1品系的鼠制备了成纤维细胞。
培养基成分：
88％ DMEM
10％ FBS
1％ NEAA
1% 双抗
对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。
小鼠胚胎成纤维细胞的消化/传代
1、移去MEF培养基
2、用5ml不含钙镁离子的PBS洗涤细胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）。
3、每个培养瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶），消化5min。
4、为了使细胞分散开，轻轻吹打细胞。
5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA，加入至少1ml的MEF培养基以终止胰蛋白酶的消化。
6、将细胞悬液加入到15ml的锥形管中，吹打几次，使细胞分散为单个的。
7、在新的T75培养瓶中加入10mlMEF培养基。
8、将细胞悬液分装到新的T75培养瓶中，放在37℃培养箱中进行培养。
注释：
MEF培养基成分：
89% DMEM (Gibco # 12100-046)
10% FBS (Gibco # 16000-044)
1% NEAA (Gibco # 11140-050)
MEF每传一代就会生长得更慢些。你第一次传代的比例可以是1:5，但是最后一次的传代（第4代或第5代）比例应该是1:2。
小鼠胚胎成纤维细胞的冻存
重悬培养基：
80% DMEM
20% FBS
1% NEAA
冻存培养基：
60％ DMEM
30％ FBS
20％ DMSO
1、用不含钙镁离子的PBS洗一次细胞。
2、加入胰蛋白酶/EDTA37℃消化大约5min。
3、将细胞吹打下来。
4、加入与胰蛋白酶/EDTA等体积的培养基以终止胰蛋白酶的消化。
5、吹散大块组织。如果还有大块组织存在，可将悬液加入到50ml的管中使其沉淀。
6、取上清液，将其分装到锥形管中，1000rpm离心5min。
7、每个冻存瓶中加入0.5ml（冻存液的一半体积）的重悬培养基重悬细胞。
8、逐滴加入等体积的（0.5ml/瓶）冻存培养基，混匀。现在DMSO的浓度是10％。
9、每个冻存瓶中加入1ml的细胞。
10、迅速将细胞转移到冻存的容器中，-70℃冻存过夜。（细胞不能长时间放置在室温而含有DMSO的情况下）
11、第二天将细胞放于液氮中长期保存。
注释：
提前标注好冻存细胞的以下信息：
细胞系名称
传代的代数
冻存细胞的数目
日期
Initials
注明冻存/解冻形式
小鼠胚胎成纤维细胞的解冻/复苏
1、将冻存瓶从液氮中取出。
2、放在37℃水浴中快速解冻，being careful not to immerse the vial above the level of the cap.
3、当仅还有一点冰晶残留时，用95％的乙醇消毒冻存瓶的外面，并将其置于hood中。（为什么用95％的乙醇消毒？hood是什么？）
4、轻轻地上下翻转细胞一次，将它们放入15ml锥形管中。
5、想管中逐滴加入10ml培养基。这一步操作不能少于两分钟。做快了对细胞将是一种打击，你将得到比其他方法具有更低生活能力的细胞。
6、1000rpm离心5min。
7、将细胞重悬于10ml培养基中，然后放入T75培养瓶中。
8、放入37℃培养箱。
9、注明冻存/解冻的形式，以更新数据。
