( 5 ) Arndt 等设计了一个多肽库。此库的设计基于 Jim-Fos 杂二聚，库中 b、c 和 f 残基来自于各自的野生型蛋白，a 位和 d 位为 Val 和 Leu ( 带有 a3Asn 在核心的插入例外，此插入引导期望的螺旋取向和寡聚态），e 和 g 残基则用三核苷酸作改变以得到等摩尔的 Arg、Lys、Gin 和 Glu 混合物（见注 7；参考文献 [8])。出人预料的是，最好地选择出来的成功者-Winzip-A2B1 杂二聚体（见注 18)，在 g/e' 位缺少完全互补的带电残基，尽管选择过程是很彻底的。更确切些说，6 个 g/e' 对的两个预测为排斥的，提示得到的序列偏离简单的电荷互补规则（ PV 假设)。可以假定，整体静电势（包括分子内和分子间相互作用）起主要的作用，并且与核心残基的作用，如像有利的堆积或立体冲撞，也可以调节这些 g/e' 作用（见参考文献 [ 8 ] 和 [ 31 ] 及其中引用的文献 )。这样的观察与天然发生的盘绕螺旋相符，这些天然结构通常有复杂的相互作用模式。这些盘绕螺旋必须满足一些标准，如生物稳定性和在家族内的极高特异性，而与其他盘绕螺旋家族间没有交叉反应 [46]。

3.2.3 螺旋取向

盘绕螺旋多数折叠为平行排布，但是，越来越多的测定了结构的蛋白质含有反平行的盘绕螺旋结构域 [47] 。与反平行盘绕螺旋的生物学重要性逐渐得到承认相反，对这类分子的研究被没有行为规范的模型体系所牵制。例如，在像丝氨酰转移 RNA ( t RNA ) 合成酶或丁型肝炎抗原那样的蛋白质中发现的反平行盘绕螺旋，都被证明足以实现没有更进一步结合的二聚化。

Hodges 及其合作者第一个报道了全新设计的，被内部二硫键限定在反平行取向的盘绕螺旋的表征 [48] 。这一以及其他设计的反平行盘绕螺旋，分别比它们的有几乎等价的螺旋间相互作用的平行对应物更稳定 [49，50]。这些数据显示，假定其他一切都是等价的，螺旋偶极相互作用（见 3.2.4.3 ) 偏好反平行取向。

3.2.3.1 核心残基

在平行盘绕螺旋中，互相堆积的核心残基有 a-a' 和 d-d'。在反平行盘绕螺旋中有 a-d' 和 d-a' 中心堆积，产生同样的堆积层 [51]。

( 1 ) 已经证明，Ala 残基在全新设计的盘绕螺旋核心的相对位置可以控制平行或反平行取向 [ 见 3.2.1.1 ( 3 )；参 考文献 [52] ] 。通过细心地放置 Ala 在中间的七元重复中，全平行的或全反平行的四聚体都可以形成。在分子中间核心位置的七元重复的中间两层平面用另一种不同的残基对 Ala 和 Leu (Ala- Leu- Ala- Leu) ，也可以达到同样目的。这样由大小两种残基交替组成的核心（Ala- Leu- Ala- Leu) 是引入小侧链的最好办法。在平行安排中，堆积会是在一个平面中都是 Ala，而另一个平面中都是 Leu，于是导致一个大空洞从而溶解核心并使分子不稳定（ 见注 19)。

( 2 ) 在一个类似实验中，二聚的 GCN4-p1  ( 见注 2 ) 核心 Asn 被变为 Ala。结果是得到反平行三聚体，以避免核心空洞 [53] 。但是，在苯存在的条件下，得到的是平行三聚体，苯结合在核心空洞中。

( 3 ) 在最近称为 APH 的反平行同二聚盘绕螺旋的设计中，疏水核心中的 β 分支的立体匹配（lie 于 d 位）和截断的侧链（Ala 于对面的 a' 位）以及其他特性 [也见 3.2.3.3 (3)] —起被用来启动反平行取向。平行排布在 lie 的 d 层是能量上没有优势的，从而很差地被放在二聚盘绕螺旋中（见 3.2.1.1 )，和疏水核心的 Ala-Ala 空洞从能量上排除（见注 20)。

3.2.3.2 极性核心残基

与平行盘绕螺旋相似，与对应掩埋的极性残基也在规定螺旋取向上起到关键的作用。

( 1 ) 在平行盘绕螺旋中，普遍地观察到 a-a' 的 Asn 配对 ( 见 3.2.1.2 )。但是，在反平行盘绕螺旋中，对应的 a-d' 位并未观察到这种配对（综述见参考文献 [47])。确实，在反平行盘绕螺旋中的 Leu-Leu 相互作用比在平行的核心堆积中更稳定 [49]，并且很可能是 Asn-Asn 相互作用和静电相互作用（见 3.2.2.3 和 3.2.3.3 ) 导致平行构象相对于反平行构象的特异性。

( 2 ) 尽管在天然蛋白中没有 Asn-Asn a-d' 配对，Oakley 和 Kim 修饰了平行杂二聚盘绕螺旋肽拉链，使得仅当螺旋在反平行取向时，才可以存在掩埋的极性相互作用， ( 即 a-d' 配对；参考文献 [56])。据估计，这一掩埋的极性相互作用给予约 2.3 kcal/mol 中等程度的反平行偏向（见注 21)。但是，仅在掩埋的极性相互作用与引进平行取向时电荷排斥两者结合时，才能排它性地形成反平行盘绕螺旋 [见3.2.3.3 (2)]。

( 3 ) 与在平行二聚盘绕螺旋中存在的 a-g' 或 d-e' 相互作用可以比较（见 3.2.2.2 )， a-e' 或 d-g' 相互作用可以出现在反平行盘绕螺旋中。例如，在丝氨基 tRNA 合成酶盘绕螺旋中，一条链上 d 位的 Arg-54 和另一条链上 g' 位 的 Glu-74 [ 57]，或者在 GreA 盘绕螺旋中的 a-e' 相互作用。据假定，这种类型掩埋的极性相互作用也可能在取向特异性中起作用。Oakley 的小组取代了肽拉链的核心 Asn 残基对，以使得在反平行取向中，Acidpi 的 a 位  Arg可以与 Basepl 的 g' 位 Glu 作用（见注 22；参考文献 [59])。平行构象的稳定性会被潜在的 e' 位 Lys 的排斥作用降低。但是，与 Campbell 和 Lumb 的研究一致 [ 见 3.2.2.2 ( 2 ) 和注 14；参考文献 [38]]，虽然核心引进 Arg 后能够促进二聚化，但并未发现对反平行或平行取向有明显的偏好。两种状态的自由能差估计仅有（0.1±0.1 )  kcal/mol。一个可能的解释是归因于与邻近的 g 位 Glu 形成了螺旋间相互作用。

3.2.3.3 边缘残基

在平行盘绕螺旋中，极性的 e 位和 g' 位产生有利的作用。在反平行的盘绕螺旋中，e 与 e' 作用，g 与 g' 作用，结果是一个螺旋被等效地旋转了 180°。这种倾向性的改变，在取向选择上有着重要作用。

( 1 ) Monem 等设计了平行的和反平行的盘绕螺旋，预计会有链间吸引或排斥 ( 见注 23； 参考文献 [49] )。确实发现，在主要的取向中有带相反电荷氨基酸间的静电相互作用。

( 2 ) Oakley 的小组改进了早先设计的反平行杂二聚盘绕螺旋 [见 3.2.3.2 (2)]。 在他们的第一个设计中 [56]，在 e 位和 g 位，一条肽链仅含 Glu，另一条肽链仅含 Lys ( 见注 21)。在他们的新设计中，替换了每条肽链的 g 位残基，以使得所有潜在的吸引作用都预计只在反平行取向存在（见注 24；参考文献 [60])。相反，两个潜在的库仑排斥作用预期存在于平行取向中，并且确实证实了反平行排布的强烈向。

( 3 ) 在最近设计的反平行齐二聚盘绕螺旋 APH [ 也见 3.2.3.1 (3)]，N 端 e 位和 g 位的 Glu 与 C 端 e 位和 g 位的 Lys 被用来引导反平行取向，结果在反平行排布得到 8 个潜在的库仑作用，在平行排布得到 8 个潜在的排斥作用（见注 20；参考文献 [55])。

3.2.4 稳定性

达成有利的稳定性是大量效果相反的焓和熵的净结果。结果是得到一个具中等程度稳定性的蛋白质，进化后可以在生理条件下与其伴侣蛋白相互作用，但不是稳定到不会解离的程度。达到这个平衡，是核心和边缘残基以及它们的相互作用、螺旋长度、成螺旋的倾向、溶解度和螺旋戴帽的结果。本节讨论这些稳定化因素。

一个重要而微妙的因素是溶解度。参与的螺旋必须有一非极性内核，以容许有利的相互作用，但螺旋的整体非极性必须不至于强到在工作条件下发生聚集。残基 a 和 d 必须形成一个连接两个螺旋的疏水带，e 和 g 典型地应该是极性残基，参与保证只有真正的结合伙伴与螺旋作用（即与非作用伙伴结合时变得不稳定），并增强核心导致的稳定性。这把剩下的残基留在了七元重复中的位置 b、c 和 f 上，以使电荷平衡和保证螺旋稳定且可溶。Glu 和 Lys，也有非常适合的螺旋倾向。带电残基也可与螺旋偶极有利地作用 ( 见 3.2.4.3 )，还可以与螺旋内一圈以外的带电残基有利地作用。这给予在离开二聚界面的地方，暴露于溶液的位点选择这些残基的额外优点。在溶液暴露位置插入 Tyr 有利于肽浓度测定。粗略地说，对原型的二聚盘绕螺旋，如 GCN4 和 Jun 蛋白，在这些位置Lys、Asp、Arg、Glu 和 Asn 有优势。虽不常见，但也存在的是 Ala，也许在附近空间的残基引起整体 α 螺旋倾向降低的情况下，可以认为它给螺旋以额外的稳定性。