关注公众号

关注公众号

手机扫码查看

手机查看

喜欢作者

打赏方式

微信支付微信支付
支付宝支付支付宝支付
×

蛋白质沉淀技术(二)

2020.8.17

(4) 小心倒出上清液,并测量其体积。依据表 20.1 所示的以百分饱和度从低到高的顺序加入 AS 以确定所需 AS 的质量。继续伴以快速的搅拌并缓慢加入 AS,以避免局部形成较高盐浓度,之后静置 30 min, 使其形成沉淀。

(5) 如步骤 (3) 中所示进行离心。尽量去除上清液, 若之前已经仔细地进行了沉淀的预实验,则沉淀中会含有 90% 或更多的目标蛋白质。该蛋白质可溶解于适宜的缓冲液中,经过透析、脱盐和稀释后,便可用于下一步的纯化操作。

3.AS 沉淀实验的实施

一般地,提高 10% 的 AS 饱和度可以使 90% 目标蛋白质发生沉淀, 所以我们应该限制「AS 区间」的范围, 使其不超过 1 〇%(如蛋白质刚好在 30% 的饱和度溶解,但是在 40% 饱和度时发生沉淀,将此称为 30%?40% 的 AS 区间)。

如图 20.2 所示方法,仅采用两步离心操作便可以确定最佳 AS 沉淀条件。基本上,首先将细胞提取物置于一个容器中,如取 10 mL 样品分别加入到 5 个离心管中。依据表 20.1 向离心管中分别加人固体 AS, 使其饱和度分别达到 20%、30%、4 〇%、50% 和 6 〇%,静置 30 min 使蛋白质沉淀, 接着离心去除不溶性的物质。沉淀即分别为 20%、30%、40%、50% 和 60% 饱和度 AS 沉淀。测定相应上清液的体积,并再次加入 AS, 分别提高 10% 的饱和度。继续混匀后,使溶液静置 30 min, 待其沉淀后离心。所得的 5 份沉淀即为 20%?30%、30%?40%、40%?50%、50%?60% 和 60%?70% 的 AS 区间。再将其分别溶解于缓冲液,进行酶活力和总蛋白质含量的分析,必要时也可进行 SDS 凝胶分析。

仍具有活力的大多数蛋白质的大多数活力应在其中一个区间中。例如,30%?40% 区间活力为一半,40%?50% 区间活力为一半,那么 35%~45% 区间可能会是最佳 AS 浓度范围。虽然这种实验看起来显得比较絷琐,但是在沉淀步骤中确定可以富集更多蛋白质的最佳条件时,这无疑是一种十分有效的方法。

4.说明、问题、解决方法

(1) 得到的沉淀并不结实在离心之后,若 AS 沉淀形成得不结实,那么将很难将上清液完全倾出。一个简单的解决方法是将离心时间延长 50%,那么在离心管底部的沉淀物将会有更多的时间变得致密。松散沉淀物形成的另一个原因是其中存在 DNA,它增加了溶液的黏度,从而降低沉淀形成的速率。如是黏度的问题,一个方法是可通过更长时间的超声处理来破碎细胞, 使 DNA 被剪切成更短的片段来解决; 另一个方法是采用重组的核酸酶 Benzonase(EMD/Novagen) 进行处理。

(2) 在高浓度 AS 中形成球状悬浮物因为较髙浓度 AS 的密度与蛋白质聚集体的密度相当,所以通过离心处理后,AS 沉淀物可能会以悬浮物的形式存在,而不是以沉淀的形式存在于离心管底部。这很可能是因为蛋白质中含有部分脂类或者周围存在一些非离子化的去污剂与蛋白质结合使其密度降低。

(3) 很难按照已经发表的方案进行操作许多已经发表的方案并不是按照既定 AS 饱和度(在 0°C、20°C 或 25°C 时的饱和度) 或提取物的蛋白质浓度来进行的。因此需要注意的是,沉淀所需的 AS 量取决于蛋白质的浓度。

(4) 不得不中断 AS 沉淀步骤若须停止沉淀,可以将蛋白质保留在 AS 沉淀中。蛋白质在 AS 中是十分稳定的,析出蛋白质的悬液或沉淀都是如此。

二、PEI 沉淀

1.原理

PEI,其商品名称为聚乙烯亚胺 (polyminP),它是由巴斯夫 (BASF) 生产的一种碱性阳离子聚合物,大量地用于纺织和造纸工业中。PEI 是通过乙烯亚胺的聚合作用得到的碱性多聚体,其结构为:CH3CH2N—(-CH2CH2—NH—X-CH2CH2NH2。经典 W 值为 700?2000, 相应所得到聚合物的分子质量为 30OOO?90OOODa。因亚氨基的 pKa 值为 10?11,所以在中性 pH 溶液中 PEI 带正电荷。采用;PEI 进行蛋白质分离起源于 Boe-hringerMannheim,Zillig 等 (1970) 进行了相关报道。将其用于蛋白质纯化的更多实例可参见几篇已发表的综述 (Burgess,1991;BurgessandJendrisak,1975;Jendrisak,1987;JendrisakandBurgess,1975)0 可以认为 PEI 类似于可溶的 DEAE 纤维素。PEI 可结合于带负电荷的大分子,如核酸和酸性蛋白质,进而形成 PEI 的网状结构,随后结合的酸性分子会快速形成沉淀。这种结合是以化学计量的方式进行的。较重的沉淀可以快速地形成,并可通过 5000r/min 离心 5 min 收集。酸性蛋白质是否可与 PEI 结合取决于盐溶液的浓度。在较低盐浓度 (0.Imol/LNaCD 时,微酸性的蛋白质会与 PEI 结合并形成沉淀,但是在中等盐浓度 (0.4mol/LNaCl),它可以从多聚体上被洗脱下来,变得可溶。强酸性蛋白质在低盐浓度中会与 PEI 结合,但在中等浓度不会溶解,高盐浓度 (〇.9m 〇 l/LNaCl) 时才能被洗脱下来。应该注意的是,当蛋白质从 PEI 颗粒中被洗脱下来时,蛋白质和 PEI 本身都会变得可溶。所以, 在返回到低盐浓度前,需要将 PEI 从蛋白质中去除(参见本章 3.2?3.5 节)。

2.PEI 的不同使用方式

存在以下 3 种不同的 PEI 沉淀使用策略。

策略 A: 在高盐浓度 (Imol/LNaCl) 采用 PEI 沉淀。该方法会沉淀核酸, 同时几乎所有的蛋白质留存于上清液中。

策略 B(对于中性或碱性蛋白质而言): 在〇.Im 〇 l/LNaCl 的条件下采用 PEI 沉淀,可去除核酸和酸性蛋白质。同时目标蛋白质留存于上清液中。

策略 C(对于酸性蛋白质,如 RNA 聚合酶): 这种方案将会在下文中进行详细的讨论,它是以 Burgess 和 Jendrisak(1975) 的方法为基础,并由 Burgess 和 Knuth(1996) 改善。


推荐
关闭