锐博生物：环状RNA研究的方法及功能作用介绍
锐博生物：环状RNA—隐秘的未知RNA平行宇宙
环状RNA，被喻是隐秘的未知RNA平行宇宙。最近，复旦大学的郑秋鹏博士（2016交流会嘉宾之一）以第一作者身份在Nature Communications上发布了他们关于circHIPK3的最新研究成果。现在就和小编一起来学习circRNA的研究思路，认识圆圈重塑的RNA世界吧。
环状RNA测序的样本选择、分析方法
RNA测序分析来自6个正常组织（脑、结肠、心脏、肝、肺、胃）和7个癌症组织（膀胱尿路上皮癌、乳癌、结直肠癌、肝癌、胃癌、肾透明细胞癌、前列腺癌）的去核糖体RNA后的总RNA，发现了67,358个潜在的环状RNA，其中27,296含有至少两个unique back-spliced reads。
研究者使用RefSeq database 24对这些环状RNA进行注释；环状RNA表达差异使用Wilcoxon rank-sum test计算，比较癌症样本与相应正常组织样本。
初步鉴定预测的新环状RNA
为排除它们是线性的反式剪接产物，研究者检测了它们的物理特性。针对36个共同表达的待鉴定环状RNA转录本，设计了Outward-facing引物。每对引物分别扩增一个来自HEK-293T cDNA的不同产物。在RNase R处理后，全部36个back-spliced序列都明显存在。
选择哪个环状RNA继续下游功能研究呢？
通过锚点比对 (Anchor alignment)，根据它们的线性形式，给测序数据中每一个环状RNA进行丰度定量。研究者检测了它们的5’端和3’端成环比 (circular ratio，CR)，以5’ CR>0.2； 3’ CR>0.2； SRPBM>1为标准时，得到了990个高丰度表达的环状RNA。研究者留意到，这里面的其中一个环状RNA来自于HIPK3基因Exon2，命名为circHIPK3，丰度与back-spliced（反向剪接）比都很高。
多维尺度法筛选高丰度circRNA。红点和黑点分别表示高丰度和低丰度circRNA，circHIPK3以蓝点显示。灰色部分为筛选得的高丰度circRNA。
环状RNA研究第一步：鉴定环状
研究者使用outward-facing引物扩增出了预期大小的不同产物，并通过sanger测序确定了序列。环状的表达水平通过qRT-PCR检测，结果与RNA-seq一致，在多种组织里的表达量均高于其线性形式。
然后研究者检测了它在HeLa细胞中的稳定性和定位情况，用Actinomycin D（转录抑制剂）处理细胞后，环状RNA仍具有高稳定性，并能抵抗RNase R外切酶消化，表明它确实为环状形式。
e) qRT-PCR显示了circHIPK3和HIPK3 mRNA在HeLa细胞质或核。f) circHIPK3的RNA FISH实验。
circHIPK3是如何形成的？
HIPK3 Exon2两侧的外显子分析显示，高度互补Alu重复序列与28个短散在重复序列 (SINE) 处在HIPK3 Exon2上游的内含子中，51个SINE处于Exon3下游。研究者使用CRISPR/Cas9技术，去除了HEK-293T细胞中的circHIPK3侧翼Alu序列，结果发现下游Alu序列删除后，环化被抑制，但上游Alu删除后不仅没有减少circHIPK3的生成，还稍微增加了。
示意图显示基因组上HIPK Exon2区域含有侧翼Alu重复序列和长内含子。Alu元件和长内含子使用CRISPR/Cas9系统进行删除(gRNA1-6)。在gRNA两侧的引物用于检测删除效果(P1-5)
引物环状外显子的上游有许多Alu元件，研究者猜测内含子中有其他Alu元件可能促进环化，于是删除了上游大的内含子 (gRNA5、gRNA6)，结果circHIPK3显著下调，而HIPK3 mRNA没有变化，证明删除只影响back spilcing，而不影响典型的剪接，表明带Alu互补重复序列的侧翼长内含子，是circHIPK3生成所必需的。
使用4对gRNA把序列删除(gRNA3-6)，进行普通PCR和qRT-PCR，引物位点设计在删除区域外(P4+P5)
锐博小编说
RNA是怎样变成环状的呢？
a. 在可变剪切过程中，外显子迁移，剪切形成套索结构，拉近剪切位点，促进序列成环
b. 依赖邻近的反向互补序列配对，拉近剪切位点，使其相互攻击，促进序列成环
c. 单个内含子直接成环
d. RNA结合蛋白、反式作用因子参与成环
研究功能，敲降看看
据文献报道，环状RNA可以被小干扰RNA敲降7。如下图所示，研究者使用了三种siRNA：一种靶向backsplice序列 (si-circHIPK3)，一种靶向线性转录本 (si-HIPK3)，一种靶向线性和环状共有的环状外显子 (si-both)，均由锐博生物提供。接着，研究者通过细胞增殖实验及EdU染色（锐博生物提供）观察敲降后的情况，发现si-circHIPK3能抑制几种不同的细胞生长，而si-HIPK3不能。
通过EdU试验，检测转染3种siRNA 48h后Huh-7细胞的DNA合成情况。
circHIPK3充当miRNA海绵
来自doRiNA的AGO2 CLIP-Seq公开数据显示AGO2位于circHIPK3区域。研究者进行了pull down、荧光素酶报告基因实验，证明了circHIPK3可能是AGO2和miRNA结合的中间媒体。
为了寻找与circHIPK3结合的miRNA，研究者使用荧光素酶筛选miRNA文库。在424个miRNA中，有9条miRNA能够显著减弱荧光素酶报告基因活性。使用TargetScan和PicTarmiRNA预测软件，发现它们含有circHIPK3区结合位点。于是研究者把这些结合位点突变了，转染突变后的miRNA，并不能减少报告基因活性。此项结果表明circHIPK3可能是这些miRNA的海绵 (sponge)。
HEK-293T细胞转染424个miRNA mimic，进行荧光素酶报告基因实验筛选，鉴定它们是否能够与circHIPK3结合。图中标注的9个miRNA对酶活抑制较明显。
值得注意的是，这9种miRNA都能抑制细胞生长，其中miR-124效果最显著，于是研究者使用生物素偶联的miR-124 mimic（锐博生物提供），富集了大量circHIPK3。多个实验的结果综合表明，circHIPK3能够直接结合到miR-124，抑制其活性。
左图：HEK-293T细胞转染3‘偶联链霉亲和素的miR-124后，捕获得的细胞裂解液中circHIPK3水平；右图：转染si-cHIPK3、miR-124或cHIPK3载体到HEK-293T细胞，qRT-PCR检测IL6R和DLX2表达情况。IL6R和DLX2是miR-124的两个已知的增殖促进靶标，会随着circHIPK3的敲降而下调，表明circHIPK3可以挽救miR-124对它们的抑制。
锐博小编说
环状RNA有什么功能和作用？
1. 调控亲本基因表达
仅有内含子的ciRNA与pol II结合促进基因转录
有内含子+外显子的ElciRNA与U1 snRNP形成复合体，再与pol II结合，促进基因转录
2. 充当ceRNA
仅有外显子的circRNA有MRE，吸附miRNA，调控miRNA表达（miRNA海绵）
3. 作为疾病的biomarker
上海研究者：Exosomes里也有环状RNA
4. 成为新的疾病治疗靶点
原文：Zheng Q, et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nat Commun. 2016 Apr 6；7:11215.
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标签： 环状RNA 非编码RNA ceRNA
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