3.注意事项

（1）避光下准备反应体系：由于光敏生物素醋酸盐对光敏感，应避免光照。在分装试剂及核酸与光敏生物素混合时应在暗室安全灯下操作。

（2）核酸纯度：由于光敏生物素能与任何有机物反应，因此用做标记探针的核酸要高度纯化。用作标记探针的核酸最好不用Tris溶液溶解，Tris中所含氨基会干扰标记。

（3）光照标记时间：光照时间不应太长。如果核苷酸上标记光敏生物素过多，会因空间位阻而影响探针与靶序列的杂交。一般认为，每100～400bp标记上一个光敏生物素分子。此法适用于大于200bp的核酸片段的标记，小片段标记率不高。

（4）光敏生物素用量：光敏生物素的活性基团是碱基，反应中加量不能太多，否则会产生氮气泡。一般为1 μg DNA用1～2μg光敏生物素。

二、原位杂交

原位杂交（in situ hybridization）用特定标记的已知碱基序列核酸作为探针与组织、细胞中待检测核酸按碱基互补配对的原则在原位进行特异性结合，形成杂交体，然后用与标记物相应的监测系统，通过免疫组织化学方法在被检测核酸原位进行细胞内核酸定位。原位杂交可根据检测物而分为细胞内和组织切片原位杂交；根据其用探针及检测核酸的不同可分为DNA-DNA、RNA-DNA、RNA-RNA杂交。根据标记方法不同可分为放射性探针和非放射性探针。

其基本方法包括：固定、切片、杂交、显色等主要步骤。

(一)取材与标本固定

1.取材　对于原位杂交所用的材料要尽可能新鲜，为了防止RNA的降解，取材要迅速，取材后要尽快固定或冷冻保存。

2.固定　进行原位杂交的组织或细胞必须经过固定处理，固定的目的是为了①保持细胞形态原有结构；②最大限度保存细胞内的DNA或RNA的水平；③使探针易于进入细胞或组织内。

3.固定液　常用固定液有10％甲醛、4％多聚甲醛、冰醋酸-酒精混合液、Bouin氏固定液等。这些固定液都有不同的优缺点因此要根据具体的实验对象，选择最佳的固定液。

4.固定方法　组织标本取材后，迅速放入固定液中2～4h，取材组织大小为>1cm×0.5cm，不宜太大。必要时，动物组织可进行灌流固定，然后将组织按要求取材放入20%蔗糖中，4℃过夜，次日可行冰冻切片。

(二)切片及细胞标本的制备

1.载玻片的处理　因为原位杂交一般在载玻片上进行，所以载玻片必须保持清洁且不能有任何核酸酶的污染。一般载玻片可先经洗衣粉浸泡过夜，用流水冲洗、酸中浸泡4～8h，再用流水冲洗，双蒸水洗2～3次。在160℃烤箱中烘烤2～4h。亦可经15磅高压灭菌20min处理，可将载玻片上的核酸酶消除。

2.组织切片与预处理

（1）冰冻切片：新鲜组织也可在取材后，直接置入液氮中迅速骤冷，冷冻切片后，4％多聚甲醛固定5～10min，也可保存在-70℃中待用。杂交前切片迅速恢复至室温并干燥，0.1mol PBS洗三次，2×SSC洗10min，滴加预杂交液室温孵育1h。

（2）石蜡切片：组织固定后，常规石蜡包埋切片，可长期保存，随时用于原位杂交。杂交前切片经①二甲苯脱蜡2次，每次10min；②纯酒精洗2次，每次5min；③空气干燥5min；④梯度酒精复洗95％，80％，70％各1min；⑤0.1 mol PBS洗3次，每次5min；⑥2×SSC洗10min；⑦滴加预杂交液于湿盒内室温孵育1h。

（3）培养细胞：每张载玻片滴加200μl浓度为1×105/m1的细胞悬浮液，空气干燥1～2min制成细胞涂片，也可直接用培养细胞盖片。上述细胞片经酒精或多聚甲醛固定5min，其余步骤同冰冻切片。