实验入门第四讲——PCR技术
一、PCR是什么
聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA（或RNA）片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。
PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
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模板 DNA 的变性：模板 DNA 经加热至 94℃ 左右一定时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；
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模板 DNA 与引物的退火 （复性）：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55℃ 左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；
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引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在 Taq 酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。
重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的「半保留复制链」，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4 分钟， 2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
3.建立体系、上机：
PCR需要用到的DNA聚合酶、buffer、dNTPs。而经常用的DNA聚合酶有Taq酶，买的同时会附送10×buffer(主要成分是KCl、Tris-HCl和MgCl2，有些还有(NH4)2SO4)。做PCR之前要提醒大家一点，不是所有的PCR都用同样的反应体系的，也就是说PCR体系里用到的试剂除了10×Taq Buffer以外，其它其实都是需要摸条件的，但是按大多数情况来说，需要调整的并不多，可能需要调整的主要试剂是MgCl2（其实是要调整Mg2+的浓度）；可能需要控制的条件主要是退火温度，我在实验中用到的体系如下：
在电泳之前，需要进行凝胶的配制，凝胶液配制的过程并不复杂，先用天平称取适量的琼脂糖粉末，加入到一定体积的1×TAE（Tris、乙酸、EDTA）缓冲液中，微波炉加热至沸腾，拿出来摇匀，帮助粉末溶解，反复沸腾多次直到粉末完全溶解。待溶液不烫手，将核酸染料加入溶液中摇匀，接着将溶液趁热倒到做胶的凝胶板上，插上梳子（用来预留加样孔），等半小时左右胶凝固拔下梳子，连胶带板一起放到电泳槽中，加电泳液至完全淹没整块凝胶（电泳槽中的电泳液也用1×TAE缓冲液）。然后将loading buffer与样品混合，加入到凝胶小空（“梳子”形成的洞）中，DNA maker作为对照，同样加入到筛孔中，然后插上电源开始跑胶就可以了，凝胶上有颜色的有两条带，等到前面的蓝色带跑到整块胶的2/3处停止电泳（断电），然后把胶拿出来，放到紫外光下观察条带。
四、常见的实验设计问题
1、如何查找引物？
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引物设计/查找非常关键，引物的好坏很大程度上决定了PCR实验的成功与否，引物的序列可以从文献中查找，找到序列以后，还是要用软件（如Primer软件）比对一下，碱基是不是每个都正确。
2、退火温度如何设置？
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通常情况下，可以尝试用两条引物中较低的Tm值减去5℃来作为退火温度，但是这种方法有时候会不适用，在不适用的情况下可以考虑做12个退火温度，这样试下去，总会找到合适的退火温度。
3、如何确定我设置的PCR的体系是正确的呢?
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做PCR的时候需要同时做个内参基因(如b-actin），因为内参基因是肯定会表达的，如果内参能做出来，证明PCR体系是没有问题的，以此来做个质控。
4、凝胶制作时需要注意些什么？
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凝胶中一个需要注意的问题就是琼脂糖的浓度，这部分参数是根据目的片段的大小选择的，一般500bp以下选择1.2%-1.5%（质量体积比）500bp-10kb可以选择0.8%-1%，分子量再高的话琼脂糖浓度就再低点，具体浓度可以摸一下条件。
五、实际的实验过程中需要注意的问题
1、如何确定引物的浓度？
前面我们说到，引物一般交由试剂公司合成，有时候具体的浓度我们也不能确定。有些人喜欢稀释十倍，有些人喜欢稀释二十倍。我个人认为比较稳妥的做法是在每次拿到反转的 cDNA 后，先会稀释 3 倍左右，然后利用管家基因做一次 RT-PCR，循环数一般为 25 循环，鉴定一下具体浓度，再决定最后的稀释倍数。
2、合成的引物是我们想要的引物吗？
一般来说在拿到很多引物的时候，可以通过普通的 PCR 看看是否是单一条带，鉴定一下引物的特异性。如果实验室不差钱，则可以通过溶解曲线对所有的引物的特异性做一次鉴定。
3、操作过程中需要注意哪些问题？
一定要戴手套，戴手套，戴手套，重要的事情说三遍。根据经验，少量模板的加入，容易造成加样误差。所以为了尽量减少加入少量模板造成的误差，我们一般会将样本再稀释一倍，加样的时候多加一倍，减少 H2O 的加入量。
4、你确定你的 PCR 板和仪器配套吗？
如果你用的是 BIO-RAD 公司的定量 PCR 仪器，那么你一定要买配套该仪器的 qRT-PCR 板。因为不兼容的 PCR 板会导致结果偏差。这种状况实验小白尤其需要注意。
5、凝胶放入电泳槽有什么注意事项吗？
凝胶放入电泳槽时一定要注意方向，核酸是带负电的，所以电泳的方向是从负极向正极跑，因此，加样孔一定要对着负极放置，不然样本就跑到胶外面去了。
