CRISPR/Cas9条件性基因敲入鼠的鉴定方法

基因工程小鼠基因型PCR鉴定的基本原则是利用基因工程小鼠基因组与野生型小鼠基因组的序列差异，以小鼠基因组DNA为模板进行PCR，并以凝胶电泳比对比不同基因型特异产物的大小，根据条带大小来区分小鼠的不同基因型。上期我们讲述了CRISPR/Cas9条件性基因敲除鼠的鉴定，今天我们就开始学习CRISPR/Cas9条件性基因敲入鼠的鉴定。

验证F1代flox鼠打靶是否正确

01 引物设计

F1/R1验证5'arm打靶是否正确，F2/R2验证3'arm打靶是否正确，F4/R4验证插入区域。鉴定的阳性鼠继续进行Southern Blot的验证。

02 预期片段大小

条带1的大小为：F1/R1扩增的5'arm端，包括野生型骨架区+同源臂+loxP+敲入区域；

条带2的大小为：F2/R2扩增的3'arm端，包括野生型骨架区+同源臂+loxP+敲入区域；

条带3的大小为：F4/R4扩增的插入片段。

备注：条带1和条带2是对同源臂骨架区的验证，片段一般是2kb以上，扩增难度较大。

03 电泳结果

若电泳结果同时有条带1、条带2、条带3，则为阳性flox鼠；

若没有扩增出目的条带的则为阴性鼠（野生型或其它突变）。

04 测序

除了PCR鉴定，还需要将产物送测确认。F1/R1扩增产物的测序引物设在靠近loxP位点的5'arm上（图示中的F3），F2/R2扩增产物的测序引物设在靠近loxP位点的3'arm上（图示中的R3）。

flox鼠的基因型鉴定

01 引物设计

交付的F1代小鼠已验证过同源臂打靶的正确性，现只需通过验证目的基因小于1 kb的片段即可，一般设计在特异性好的loxP附近。

02 预期片段大小

条带1的大小为：F5/R5扩增的5'arm端的野生型；

条带2的大小为：F6/R6扩增的5'arm端的同源臂+loxP+敲入区域；

03 电泳结果

若电泳结果只有条带1，则判断为野生鼠（+/+）；

若电泳结果只有条带2，则判断为阳性纯合鼠（flox/flox）；

若电泳结果有条带1和条带2，则为阳性杂合鼠（flox/+）。

鉴定Cre鼠删除效率

纯合或杂合flox鼠与Cre鼠交配的后代需要鉴定删除效率，验证是否发生删除需要先鉴定Cre基因，若鼠尾为Cre阳性再取特异性组织进行验证。

01 引物设计

在5'arm与3'arm上设计引物，位于cKI区域的上/下游。

02 预期片段大小

条带1的大小为：F6/R7扩增的打靶载体片段大小；

条带2的大小为：F6/R7扩增的删除后的片段大小；

条带3的大小为：F6/R6扩增的5'arm端,同源臂+loxP+部分敲入区域；

条带4的大小为：F5/R5扩增的5'arm端,野生型；

注：F6/R7可能会因片段太大或者基因组的提取效果差而扩增不出条带。

03 电泳结果

若电泳结果只有条带2，则判断为cKI纯合子（即2条染色体均发生删除）；

若电泳结果有条带2和条带4，则判断为cKI杂合子（即1条染色体发生删除）；

若电泳结果有条带1或者条带3，则可能是由于Cre删除效率低，loxp之间的区域没有发生删除。