载体　所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。

细菌质粒 是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。最常用的质粒是pBR322。

噬菌体（phaeg） 噬菌体是感染细菌的病毒，按其生活周期分为溶菌型及溶原型两型。用野生型λ噬菌体改造和构建的噬菌体载体是线性双链DNA，基因组约为50kb，最常用的哓菌体为λDNA及其衍生系列。

黏性质粒（cosmid） 是由质粒与噬菌体λDNA组成的一种4-6kb的环状杂种DNA。

表达型载体 将上述细菌质粒载体或噬菌体载体接上启动基因及多聚核糖体的基因序列组成了表达型载体。

基因库的建造

含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进 一步的研。其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA的连接；（4）包装和接种。

cDNA库的建造

是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。

特异基因的筛选

常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。

核酸序列测定

DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析 （测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。无论从基因库中筛选的癌基因或经PCR法扩增的基因，最终均需进行核酸序列分析，可藉以了解基因的精细结构，获得其限制性内切酶图谱，分析基因的突变及对功能的影响，帮助人工俣成基因、设计引物，以及研究肿瘤的分子发病机制等。测序是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立起来的。目前最常用的方法有Maxam-Gilbert的化学降解少和Sanger的双脱氧法等，近年来已有DNA序列自动测定仪问世。化学降解法是在DNA的片段的5`端标记核素，然后用专一性化学试剂将DNA特异地降解，在电泳和自显影后，可得到从标记端延伸的片段供测读序列和进行比较。一般能读出200-250个核苷酸序列。双脱氧法是采用核苷酸链终止剂，如：2`，3`-双脱氧核苷三磷酸ddNTP(如ddTTP、ddTTP、ddGTP和ddCTP中的一种)掺入到DNA链中以终止链的延长，与掺入4种正常的dNTP的混合物分成四组进行反应，这样可得到一组结尾长衙不一、不同专一性核苷酸链终止剂结尾的DNA片段，经凝胶电泳分离和放射自显影，可读出合成的DNA核苷酸序列，根据碱基互补原则，可推算出模板DNA分子的序列。

化学降解法只需一化学试剂，重复性好，容易掌握；而双脱氧法需单链模板、特异的寡核苷酸引物及高质量的DNA聚合酶，便随着M13噬菌体载体的发明和运用，合成的引物容易获得，测序技术不断改进，故此法已被广泛应用。基脱氧法的自动激光荧光测序仪，使测工作更快速和简便，而且保证高度重复性。至于RNA测序现大多采用将mRNA逆转录成cDNA后同测序，然后反推RNA序列

聚合酶链反应技术

聚合酶链反应技术简称PCR技术，是一种利用DNA变性和复性原理在体外进行特定的DNA片断高效扩增的技术，可检出微量靶序列（甚至少到1个拷贝）。在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。仅需用极少量模板，在一对引物介导下，在数小时 内可扩增至100万-200万份拷贝。PCR反应分三步：变性、退火及延伸。以上三步为一循环，每一循环的产物作为下一个的模板，这样经过九小时的循环，每一循环的产物作为下一个循环的模板，这样经过数上时的循环后，可得到大量复制的特异性DNA片段。反应条件一般为94℃变性30秒，55℃退火30秒，70-72℃延伸30-60秒，共进行30次循环左右，最后再延伸72℃5分钟，4℃冷却终止反应。

1.逆转录PCR(RT-PCR)用来扩增RNA的方法。

2.竞争逆转录PCR(competitive reverse transcription-polymerase chain rection C-RT-PCR)低丰度RNA定量的好方法。

3.多重PCR（multiples PCR）在同一PCR体系中加入多对引物可用于基天长度很长，发生多处缺失的检测。扩增同一模板的几个区域。

4.多种PCR可同时加入多套以生物素标记的引物起进手PCR反应。

5.反向PCR（iverse polymerase chain reaction）对一个已知的DNA片段两侧的未知序列进行扩增和研究。

6.不对称PCR在扩增循环中引入不同引物浓度，以得到单链DNA并进行列测定，以了解目的基因的序列。

7.锚定PCR（anchored polymerase chain reaction）帮助克服序列未知或序列未全知带来的障碍。在未知序列未端添加同聚物尾序，将互补的引物连接于一段带限制性内切酶位点的锚上，在锚引物和基因另一侧特异性引物的作用下，将未知序列扩增出来。

8.着色互补试验或荧光PCR（color complementation assay or fluorescent PCR）原理是用不同荧光染粒，分别标记于不同寡核苷酸引物上，同时扩增多个DNA片段，反应完毕后，利用分子筛选去多余的引物。用紫外线照射扩增产物，就能显示某一DNA区带荧光染料颜色的组合，如果某一DNA区带荧光染色料颜色的组合，如果某一DNA区带缺失，则会缺乏相应的颜色。

9.双温PCR（two-temperature PCR）仅仅执行两步温度程序。合并退火与延伸温度。一般常用温度是94-95℃和46-47℃。可以提高反应的速度和特异性。

上述这些PCR技术的应用：（1）PCR技术扩增特定序列为基础，采用多种方法进行检测，如PCR-RFLP、PCR-SSCP从已克隆的双链DNA中产生特异性序列作为分子探针；（2）通过选择性扩增cDNA中产生特异性序列作为分子探针；（2）通过选择性扩增cDNA中的特殊片段，产生针对尚未克隆的基因的探针；（3）从微量mRNA中产生cDNA文库；（4）产生大量用于序列分析的DNA；（5）分析 基因突变；（6）做染色体步移。

10.原位PCR技术：PCR虽然能扩增包括福尔马林固定、石蜡包埋组织的各种标本的DNA，但扩增的DNA或RNA产物不能在组织细胞中定位，因而不能直接与特定的组织细胞特征相联系，这是该技术一个局限性。原位杂交虽具有良好的定位能力，但由于其敏感性问题，尤其是在石蜡切片中，尚不能检测出低含量的DNA或RNA序列。而原位PCR（In situ PCR,简称IS PCR），它可使扩增的特定DNA片段在分离细胞和组织切片中定位，从而弥补了PCR和原位杂交的不足，具有良好的应用前景。目前，已有多种设计的原位PCR扩增仪系统问世，使操作简便，软件灵活，已成为拉增固定细胞和石蜡包埋组织中特定DNA和RNA序列的有用工具。

IS PCR的技术特点

（1）既具有PCR的特异性与高灵敏性，又具有原位杂交的定位准确性；（2）测到低于2个拷贝量的细胞内特定DNA序列，甚至可检测出单一细胞中的仅含一个拷贝的原病毒DNA；（3）有助于细胞内特定核酸序列定位与其形态学变化的结合分析；（4）可用于正常或恶性细胞，感染或非感染细胞的鉴定与区别。

IS PCR的基本方法

IS-PCR是PCR和原位杂交两种技术的绫事，实质是一种将靶DNA或RNA在原位扩增后再进行原位杂交的技术，操作程序基本兼有两种技术的所有过程，首先在适当处理的细胞和组织切片上滴加PCR反应液，然后把载玻片放入热循环仪中进行扩增，最后通过标记的探针进行原位杂交检测扩增产物。