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甲基化和异戊烯化作用检测—多聚类异戊二烯取代物确证

2019.4.03
实验材料

蛋白

试剂、试剂盒

牛血清白蛋白氢氧化氨

仪器、耗材

试管

实验步骤

1. SDS-PAGE 和电洗脱分离目的蛋白。

2. 洗脱的蛋白中加牛血清白蛋白载体使最终浓度为 0.1 mg/ml,并用 5 倍体积的含 1.5% 氢氧化氨的冰冷丙酮处理 30 分钟以沉淀蛋白。

3. 离心收集沉淀蛋白,倒掉上清,在真空下干躁沉淀物。

4. 在 0.4 ml 的乙醇:甲酸(4:1 ) 溶液中重悬蛋白,并转到一个带玻璃螺丝帽的试管中。



5. 加 0.1 ml 的拉尼镍混合液(Aldrich),然后加 1 ml 水饱和戊烷。

6. 用 Teflon 带绕细线封紧试管,并用 Teflon 线拧上一个帽。

7. 在 100℃ 热块上加热试管过夜。

8. 取出顶层保存在一个新试管中,然后再用 1 毫升戊烷再次抽提底层。

9. 收集戊烷层于圆锥型样品瓶中,在盐水冰浴中蒸发到干燥。

10. 用 100~200 μl 的己烷清洗试管的侧壁,将己烷溶液倒入一个干净的锥形样品瓶中,并且蒸发至较少的体积(10~20 μl)。

11. 通过放射气相液体色谱法分析样品,使用 15 m、DB-5、中等极性的百万孔的柱子去分离并按照下列条件走柱:

后始温度,100℃;启始时间,4 分钟;速率,每分钟 10°。最终温度,300℃;最终时间,1 分钟。


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