首次实现！非病毒、无质粒产生可表达抗CD19的CAR-T细胞
美国应用DNA科学公司（Applied DNA Sciences,Inc.）近日宣布，旗下专注于下一代生物治疗的公司LineaRx通过其专有的非病毒、无质粒（non-viral plasmid-free，NVPF）制造平台在人类T细胞实现了抗CD19-CAR（嵌合抗原受体）的表达。据该公司称，这一重大事件代表了利用经由可扩展聚合酶链式反应（PCR）制造过程产生的线性DNA设计的基因构建首次在人类T细胞表达抗CD19抗体。该公司认为，该技术将成为目前使用病毒递送平台的所有基因疗法的一个重要选择，尤其是使用病毒递送合成基因来重定向患者T细胞的肿瘤免疫疗法，即所谓的CAR-T疗法。
Linearx公司独特的基于PCR的制造技术创造了编码抗CD19接合器的线性DNA扩增子，然后将该DNA构建体在体外通过电穿孔技术递送至人类T细胞。随后的测试证实，这些工程化T细胞实现了抗CD19 CAR的表达。尽管这些初步数据令人鼓舞，但总体表达水平较低，目前Linearx公司正在继续使用正在申请ZL的高表达扩增子技术（HEA）和除电穿孔外的转染方法来产生较高的转染水平，并将在之后报告这一重大成果的进一步进展。
应用DNA科学公司总裁兼首席执行官James A.Hayward博士表示，“我们的目标有三个方面：1）确定PCR生产的线性DNA作为一个平台用于快速设计和生产治疗性核酸构建体的价值，包括床旁（POC）应用；2）证明NVPF生产流程改善的安全性和治疗价值，该流程不同于目前全行业基于病毒的生产流程；3）与未来的合作伙伴一起，将我们开发的基于NVPF的抗CD19 CAR-T细胞疗法推进临床。
PCR产生的GFP基因片段在人类T细胞中的表达
这项成果建立在2018年底通过LineaRx公司PCR技术生产、设计、制造的线性DNA扩增子在工程化人类T细胞的第一个实例基础上。该实例首次证明了一种包含可编码绿色荧光蛋白（GFP）完整基因的线性DNA扩增子。如上图所示，通过高通量电穿孔技术，PCR产生的GFP基因片段在数百个人类T细胞中被摄入及随后表达，形成了绿色荧光细胞群。
2018年10月，Linearx公司宣布与Icell Gene Therapeutics签署了一项针对抗CD19 CAR-T疗法的北美独家许可和研究服务协议。结合Applied DNA公司在大规模PCR生产和DNA化学修饰方面的专业知识，该公司将利用其NVPF平台开发和生产表达载体用于多款CAR-T疗法，包括LinCART19，这是一款非病毒、无质粒的抗CD19 CAR-T候选药物。
正如2018年12月Linearrx公司在分析师日所讨论的那样，在中国开展的一项临床试验中，LinCART19所基于的CAR-T基因构建体在单次低剂量治疗后6个月，所有3例急性淋巴细胞白血病（ALL）患者均实现完全缓解。虽然这些有希望的临床结果为所使用的基因构建体提供了价值证据，但CAR-T细胞是通过病毒载体进行转染的。LinCART19将使用线性DNA，并通过电穿孔、增溶或其他方式导入T细胞，其所针对的CD19是几乎所有B细胞恶性肿瘤中表达的细胞表面蛋白，这也是目前已上市的两款CAR-T疗法的靶点。
在不使用病毒载体或质粒的情况下，Linearx公司的NVPF制造平台比现有的基于病毒/质粒的CAR-T方法具有许多潜在的优势包括：1）简化的制造流程将降低成本和交付周期；2）降低永久性遗传整合/重组进入靶细胞的风险，降低插入诱变的风险；3）细胞因子风暴治疗副作用的潜在缓解；4）靶向新抗原的最终能力足以快速影响患者；5）避免复杂和繁琐的分布式供应链，加速治疗。
Linearx公司认为，NVPF方法能够生成重要的生物治疗药物，有望重新定义“床旁”治疗，为患者提供更快速、更有效、更经济和更安全的基因治疗，将个性化癌症疗法从梦想变为现实。
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