七、个体和种族发育的研究

　　神经系统是一个历史发展的产物，有种族发育和个体发育的历史。在种系发生方面，有不同的发育规律，如一些神经肽自腔肠动物已经发生，而VIP自鱼类才开始发生。免疫反应的强弱和神经肽的含量亦因种属不同而异，如笔者对输精管的神经支配的研究表明，在大鼠、豚鼠和猫等动物，输精管管壁内有丰富的神经分布，而在人输精管神经分布异常稀疏。研究神经肽的发生可以帮助了解肽类的发生规律，有利于选择和建立实验动物模型。个体发育，不但指胚胎发育，也指动物出生后发育以至衰老的规律，神经系统的任何一个部分都可以从发育的角度去研究。在肠道，Epstein等在鸡小肠壁内神经丛的研究表明，在鸡胚发育的第7日出现胆碱能神经成分，5～7天出现5—Ht 神经细胞，NA神经终末出现于第12～16日，神经肽出现在这些递质之后。在小鼠、豚鼠和兔小肠壁内神经从发育规律的研究报告和鸡相似。神经肽的出现较晚，而神经对肌肉发育的作用更晚，如在豚鼠小肠，虽然在胚胎第25日出现了胆碱能神经细胞，但肌肉对神经的反应性出现在胚胎的第48日。各种神经肽的含量和含肽类神经细胞的数目都随发育、成长、衰老而产生规律性变化，如大鼠全脑或脑各分区中NSE的含量随发育而增高，在第13天胚胎时NSE含量为50ng/mg蛋白质，到成体（第40日）时为11000ng/mg蛋白质，而定位于神经胶质的非神经无烯醇酶（No-neuronal enolase, NNE），在第11日的胚胎为8500ng/mg蛋白质，出生后下降至5000ng/mg蛋白质，到成体（第60日）时为11000ng/mg蛋白质。以上结果表明，随着神经细胞的产生，NSE增加，而NSE/NNE比例显著增高，说明在大鼠脑神经元的分化过程中可能存在着由NNE转变为NSE的生物化学分子变化。杨恬、蔡文琴等（1994）报告了六种肽能神经在人胚胎期的发育规律，AChE神经出现最早，其它肽能神经出现时间不一，分别在第11～16周。同一个体不同器官肽能神经并非同时发生，如膀胱肽能神经出现较小肠为晚。总之，神经系统种族发育和个体发育这个领域的研究还有待于进一步发掘。

　　八、与神经组织培养技术相结合进行神经生物科学的研究

　　神经组织培养是从机体中取出组织或细胞，在模拟机体内生理条件下进行体外培养。免疫细胞化学技术可用于培养的单个细胞或组织片染色，单个细胞可直接固定或冰冻后进行免疫染色，而组织片在固定或冰冻后常需进行切片后染色。由于体外神经组织培养技术能使复杂的神经系统简单化，换而言之，能在神经系统的结构与功能的研究方面提供一个简单的模型，近年来，随着培养技术的发展和与其它科学的相互结合，在神经生物学这一研究领域中提供了不少的新资料，如利用免疫细胞化学技术可对原代分离培养的神经细胞和神经胶质细胞进行细胞的特异抗原标记（可以是细胞表面或细胞质内成分），从而区别其细胞类型，如用GFAP标记星形胶质细胞、半乳糖脑苷脂、髓磷脂碱基蛋白（myelin basic protein, MBP）标记少突胶质细胞、NSE标记神经细胞、Ran-α标记胶质细胞表面的抗原等，这些特异的标记在神经生物学和临床科研中有很大潜能，细胞表面标记能够区别活细胞，精确地研究细胞间特性和相互作用，细胞内标记能有助于对神经细胞结构、功能及相互作用的研究。Mirsky及其同事们利用半乳糖脑苷脂（GC）、硫脂（Sulphatide, S）和MBP对培养的雪旺氏神经胶质细胞和少突胶质细胞的研究表明，雪旺氏神经胶质细胞在与其所依附的轴突分离后不超过5～6天，GC、S和MBP的免疫染色均为阴性，表明雪旺氏细胞需要持续性地从相应的轴索获得信息(Signal)才能制造出可为免疫染色所检测出的髓鞘特异性糖脂和蛋白，而少突胶质细胞则否，在没有神经细胞存在的情况下培养数周，仍保持GC、S和MBP免疫反应阳性。本实验结果成功地证明少突胶质细胞和雪旺氏神经胶质细胞产生髓鞘的方式是不同的。Abney等利用培养的胚胎和新生大鼠的脑细胞混悬液进行特异性免疫标记染色，证实了不同类型细胞在脑内的发育顺序：破伤风毒素阳性神经细胞出现在第10天的胚鼠脑（测试的最早时间），GFAP阳性星状胶质细胞出现在15～16天的胚脑，而GC阳性少突胶质细胞直至出生后2～3天方才出现。利用18天胚鼠的小肠壁内神经丛培养后进行各种神经肽的免疫染色，Schultzberg等发现在这时的小肠壁内神经丛已具有内源性的VIP、SP、ENK和SOM免疫反应性神经元。

　　九、应用于受体的研究

　　由于免疫细胞化学所应用的各种标记物如铁蛋白、胶体金和荧光素等都能无例外地与配体（即与受体呈特异结合的物质）相结合，因此可应用于细胞表面（包括神经细胞和神经胶质细胞）表面受体的定位。Philips和Bennet（1987）应用抗肌球蛋白和荧光素标记的α-眼镜蛇毒素成功地显示了乙酰胆碱受体（Acetycholine receptor clusters）在鸟肌上的发育规律。近年来，应用免疫细胞化学技术进行受体再循环的免疫电镜观察，取得了令人瞩目的进展。Geueze利用胶体金-蛋白A-抗唾液酸糖蛋白的受体抗体在免疫电镜下观察证明，配体与细胞表面的相应受体结合后，由受体介导入肠作用而进入胞内，在入胞早期，唾液腺糖蛋白及其受体均存在于有覆衣囊泡中，并与囊泡内表面密切结合。在人胞囊泡内，则见配体游离于囊泡腔中，内移的受体可再循环回细胞表面加以利用。本实验结果为细胞膜受体的再循环提供了有力的证据。

　　十、神经系统的机能研究

　　免疫细胞化学在神经科学的应用已由单纯的形态学研究逐步向与机能研究、应用研究和临床实践相结合。如研究脑啡肽与镇痛的关系，SP与转导伤害性刺激的关系以及在各种生理和病理条件下神经肽的变化与病理生理作用机制的关系等。在研究方法上也不断改进，如免疫组化的定量研究由简单的积分法逐步走向与放射免疫测定相结合、与图像分析相结合，测定单位面积内和/或每个神经细胞内免疫反应物含量的变化。

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