反相高效液相层析实验
多肽和蛋白质的分离
| 实验材料 | 蛋白质 |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | TFA 乙腈 盐酸胍 |
| 仪器、耗材 | 层析柱 HPLC进样器 |
| 实验步骤 |
1. 用经脱气的HPLC级水洗去反相柱的有机溶剂，梯度从100%有机溶剂到100%水，流速1 ml/min，持续15 min 以上。
2. 以100%的TFA/乙腈缓冲液平衡柱子至柱压和光吸收值达到恒定。用10~15 min 的线性梯度使之逐渐转到0.1%TFA水溶液，并以0.1%TFA平衡15 min。 5. 按步骤3的梯度进行层析。收集层析峰于不同的聚丙烯管中。如果柱子的使用间隔时间超过两天时间的话，需要清洗柱子并贮存于有机溶剂中。
6. 用TFA/胍缓冲液溶解收集到多肽，用旋涡混合器使之溶解。
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| 注意事项 |
检测器的设定如下：对50 ~200 pmol 的多肽，满量程吸收单位为0.1，500 pmol 则为0.3AUFS，1 nmol 时为0.5 AUFS，2 nmol 为1 AUFS；对蛋白质而言，相应的设定应高2~3倍。
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