骨骼肌细胞损伤模型的建立

1 　材料　地塞米松磷酸钠注射液(江苏第三制药厂,批号000706) ;RPMI - 1640 培养基(GIBCO ,USA)(每升含10 %小牛血清、L-谷氨酰胺0. 33mg、青霉素100u、链霉素100u、pH-7. 4) ; 胰蛋白酶(Difco ,Lot :12885655) ; 四甲基氮唑盐(MTT) ( FLUKA , Switzerland) ;FLUO-3/ AM(CALBIOCHEM,Ca) ; 二甲基亚砜(DMSO) (MERCK,USA) ; SOD 与MDA 试剂盒(南京建成生物工程研究所) ;吖啶橙(AO) 、溴乙啶( EB )(FLUKA ,Switzerland) ;酶标仪(BIO-RAD ,USA) ;荧光显微镜(OLYPUS ,Japan) ; 激光共聚焦显微镜(BIO-RAD 公司MRC-1024 型,USA) 。SD 大鼠(南京中医药大学,动物合格证号:SCXK(苏) 2002-0012) 。
2 　骨骼肌细胞原代培养　取出生1d 的SD 大鼠四肢肌肉,切碎后用37 ℃的消化液(0. 05 %胶原酶和0. 25 %的胰蛋白酶) 消化两次,每次15min。经Percoll 密度梯度离心后,收集细胞,用Hank′s 液洗两次,199 细胞培养液(10 %胎牛血清) 悬浮细胞,接种入细胞培养皿。37 ℃培养12h 后收集未贴壁细胞并计数,种入细胞培养板,37 ℃培养 。待细胞生长并融合进行如下实验。
3 　细胞增殖测定(MTT 比色) 　设地塞米松大(5mmol/L) 、中(1mmol/L) 、小(0. 2mmol/L) 剂量组,于加药培养后的第24h 从96 孔培养板中吸取100μl 培养上清液,每孔加入25μl 浓度为5mg/mlMTT溶液后,继续培养4h ,吸去旧培养液,再向各孔加入100μl 的二甲基亚砜(DMSO) 100μl ,振荡5min ,等细胞代谢MTT后所形成Formosan 充分溶解后,用酶联免疫检测仪测定490nm 处的吸收度值。
4 　SOD MDA 测定　于加药培养后的第24h 从96孔培养板中吸取的100μl 培养上清液,按南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明进行测定。
5 　形态学方法　将骨骼肌细胞接种于处理过的载玻片上,以1mmol/L地塞米松作用24h 后,分别收集上清细胞及贴壁细胞,加吖啶橙和溴乙锭(AO/E 染液,在荧光显微镜下观察活细胞(VN) ,核染色质着绿色并呈正常结构;早期凋亡细胞(VA) ,核染色质着绿色呈固缩状或碎裂状; 晚期凋亡细胞(NVA) ,核染色质着橘红色呈固缩状或碎裂状;坏死细胞(NVN) ,核染色质着橘红色并呈正常结构。并计算损伤率:
损伤率= [ (VA + NVA + NVN) / 总细胞数] ×100 %。
6 　钙离子动态变化的测定　用敏感性钙指示剂FLUO-3/ AM,结合激光共聚焦显微镜(Laser ScanningConfocal Microscopy ,LSCM) 检测技术,分析细胞内钙离子的动态变化 。储备的FLUO-3/ AM用D-Hanks液稀释至5μmol/L ,取10μl 加于培养的骨骼肌样品上,置5 %CO2 孵箱中孵育30min。然后用D-Hanks 液洗1 次,再用激光扫描共聚焦显微镜观察FLUO-3/ AM染色的骨骼肌某一层面的萤光图像。取地塞米松10μl 轻轻加入孔中,使终浓度达到1mmol/L,迅速以间隔4s 的速度扫描,计算机记录储存扫描结果, 使用软件为Time Course ( Kinetic ImagingSoftware for MRC-1024 and MRC-1024UV Confocal Imaging Systems) 及Lasersharp 数据处理软件。