光合作用水解放氧的结构基础
光合作用过程中，光系统II核心复合体接受来自外围捕光复合体II（LHCII），次要捕光复合物叶绿素结合蛋白（CP29、CP26和CP24））的激发能，以诱导称为P680的特殊叶绿素发生电荷分离，实现光能到电能的转化。这一复杂的光物理过程是由PSII的许多蛋白质亚基和各种辅助因子，包括叶绿素、类胡萝卜素、一个Mn4CaO5簇、一个血红素、质体醌和脂质体共同完成的。目前比较常见的说法是PSII核心蛋白复合体发生电荷分离后会将电子传递给脱镁叶绿素（Pheo），PSII核心复合体会形成“电子陷阱”，进而PSII的另一个特征功能特性发挥作用，通过Mn4CaO5簇蛋白诱导水氧化反应从水分子中夺取电子。PSII核心复合物的电子传递给原初电子受体，并从原初电子供体H2O中获取电子，实现了光合电子传递的起始步骤。为了更好的理解电子传递链的起始过程，本文将从放氧复合体的结构模型展开，希望能给广大读者以新的启示。
光合放氧的高等植物和藻类PSII都有放氧复合体结构。1998年H. Schiller 等人用X射线吸收光谱研究了高等植物（菠菜）和单细胞绿藻（Scenedesmus obliquus ）PS II处于暗稳定状态（S1-state）结构，其中一个发现就是绿藻和高等植物的PS II锰簇复合物的结构和取向高度相似或完全相同。
放氧复合体工作时存在中间体最早可以追溯到1955年ALLEN和Franck发现在黑暗中光合机构接受单次闪光并不释放氧气。在之后的1965-1969年间P.Joliot通过改进的极谱技术对这种放氧失活的现象进行了研究，认识到放氧失活现象为光化学产生的中间体稳定性有限。1970年，Kok,B.在前人研究的基础上研究了分离的叶绿体在弱光和闪光下的氧气释放，分析光和氧气释放，中间体及其在黑暗中衰变的关系，得出闪光总是产生与前体或氧气相同数量的氧化当量。每个光化学中心在稳态光合作用中存在的不稳定前体当量数= 1.2。四个光化学过程形成的氧化当量的协同作用基本上发生在各个反应中心，最终的O2释放步骤是一个量子过程。数据与线性四步机制吻合，在该线性四步机制中，反应中心或相关的催化剂（S）连续累积四个电荷。S4状态产生O2并返回到基态S0。除了S0态，第一氧化态S1在黑暗中也是稳定的，两个较高的态S2和S3不稳定。他们还估算了一些光氧化步骤的弛豫时间。最快的反应可能是S1*-S2），半衰期时间小于等于200μs。S2状态，可能还包括S0*状态的处理速度会稍慢一些（≈300-400 μs）。
上世纪九十年代初的诸多研究结果显示S0-S1和S1-S2跃迁都涉及锰的氧化。1998年Lucia Iuzzolino用X射线吸收光谱研究光系统II膜颗粒的结果也建议将水循环中的S2-S3 状态变化归因于放氧复合体的锰氧化。提出光合作用的放氧反应与PS II锰簇复合物中四核锰配合物的四种不同氧化态循环有关。
1999年匡廷云院士团队根据前人的研究提出新的放氧复合体结构模型及放氧机理。两个H2O分子在“ C”形簇的开口端与两个锰离子（Mn1II和Mn4III）不对称结合，并保持相当大的距离。两个组氨酸残基通过咪唑的氮原子与处于较高氧化态的另外两个锰离子（Mn2IV和Mn3IV）配位。作为末端配体结合到Mn4III的Cl连接到Ca，后者需要通过oxo桥连接羧酸配体来维持两个Mn2O2单元的特殊构型。放氧中心的整体结构是不对称的。新的放氧机理可以预测两个H2O分子的不对称氧化，放氧中心的动态结构变化和间接质子传递。
之前的大多数研究都是在推测放氧复合体锰簇蛋白的状态及其结构，KennethSauer等人在2005年的综述文章系统总结了在那之前借助X射线吸收光谱（XAS）、X射线发射光谱（XS）、共振非弹性X射线散射（RIXS）和扩展X射线吸收精细结构（EXAFS）研究的成果，提出了较为清晰而详细的PS-II中锰簇放氧复合体及其内部各元素分布的模型。
由O原子桥接的4个Mn原子的簇内排列示意图
由O原子桥接的4 Mn和1 Ca的簇内排列与Mn-和Sr-X射线吸收精细结构二色性一致
2004年3月19日，Kristina N等人在Science上发表题为Architecture of the PhotosyntheticOxygen-Evolving Center的文章。报道了在3.5Å分辨率下细长嗜热聚球藻的PSII结构，描述PSII辅助因子结合位点，提出一个新的放氧复合体（OEC）的结构。Kristina N认为放氧复合体含有一个类似立方烷的Mn3CaO4团簇并通过mono-μ-oxo桥连到第四个Mn原子。
Kristina N提出的放氧中心（OEC）模型
（A）具有侧链配体和可能具有催化作用的重要侧链残基的OEC的立体图。Mn离子，Ca2+和氧原子分别以品红色，青色和红色显示。OEC的一种未鉴定的非蛋白配体以绿色标记。蛋白质主链显示为浅灰色；侧链和碳原子遵循蛋白质亚基的颜色（D1，黄色； CP43，绿色）。σA加权2 [Fo]-[Fc]密度显示为轮廓为1.5σ的浅蓝色丝网。1.89340Å（Mn边缘，轮廓为10σ）和2.25430Å（高亮Ca2，轮廓为7σ）的异常差异傅立叶图分别显示为品红色和蓝绿色。（B）与（A）相同，但绕y轴逆时针旋转40°。（C）OEC的示意图。 D1，D2和CP43亚基中的残基分别以黄色，橙色和绿色显示。 X1，X21和X22是与Mn4（X1）和Ca2+（X21和X22）可能存在的底物水结合位置，这是根据非蛋白质配体的位置以及Mn和Ca2+离子的配位方式确定的。在当前分辨率下不可见但可能的水分子显示为W。可能的氢键显示为浅蓝色虚线。（D）活性部位和管腔之间的亲水途径（蓝色箭头）。残基的颜色与（B）相同。
Kristina N的水氧化机理。在Kristina
N之前的研究表明紧密结合的Ca2+靠近Mn离子是水氧化机理的先决条件。在S状态循环中，只有一个Mn离子与底物水分子结合，并且在形成双氧之前会生成高活性的亲电中间体，即Mn（IV）氧基或Mn-oxo基。Pecoraro等人的观点也支持Mn（V）参与水氧化。Kristina
N的OEC结构强烈表明Mn4是这种反应性Mn离子。实际上，在Kristina
N的电子密度图中检测到Mn4的X1位置在水氧化反应过程中可能被水分子或氧气中间体占据。根据上述机制，提出O =
O键的形成是由于金属离子与Ca2+连接的第二底物水分子的亲核攻击而发生的，其中该金属离子还可能部分充当弱路易斯酸，并受Mn3簇和Cl-配体的辅助。在Kristina
N的结构中，接近X1位点的Ca2+离子 X21或X22配体似乎是第二底物水分子的理想结合位。附近的残基D1 Gln165和CP43
Arg357可在形成O=O键之前提供氢键以稳定中间体。实际研究中发现，CP43 Arg357突变为丝氨酸完全抑制了氧气的释放并阻止了光合自养生物的生长。
在这之前的研究认为，水的氧化涉及质子耦合电子转移到TyrZ自由基，TyrZ和D1
His190之间的氢键不仅对稳定TyrZ至关重要。而且还为水氧化产生的质子提供出口通道。TyrZ靠近水的氧化位点，并且还可以为反应中间体提供氢键。但Kristina
N研究表明质子更有可能通过另一条途径逸出。水分子和一些残基（包括Glu189）可以将假定的水氧化位点与质子通道连接，该质子通道由将D1
Asp61（与Mn4紧密相关）连接到腔表面的极性残基形成，而无需位于OEC的另一侧TyrZ和D1 His190参与。
以上的研究让我们对PSII放氧结构有了比较清晰的认识，但受于分辨率的限制，仍有很多细节不能确定。2011年5月5日，日本的科学家Yasufumi
Umena在Nature杂志上发表题为Crystal structure of oxygen-evolving photosystemII
at a resolution of 1.9 Å的研究文章，以嗜热蓝藻为研究对象，将PSII放氧复合体的结构解析提升到一个新的高度。通过对光系统II的晶体结构1.9
Å分辨率的分析，Yasufumi
Umena找到了Mn4CaO5团簇的所有金属原子及其所有配体。发现五个氧原子充当了连接五个金属原子的oxo桥，并且四个水分子与Mn4CaO5团簇键合。它们中的一些可以用作形成双氧的底物。在每个光系统II单体中识别出1300多个水分子。其中一些形成了广泛的氢键网络，可以用作质子，水或氧分子的通道。PSII的高分辨率结构揭示了Mn4CaO5团簇及其氧桥和配体以及四个结合的水分子的几何排列。这为揭示水分解和O
=
O键形成的机理提供了基础。此外，该研究对氨基酸侧链和辅因子的精确排列的确定使我们对PSII内发生的能量迁移，电子转移和水分解反应有扎实的结构理解。
Yasufumi Umena提出的Mn4CaO5团簇结构模型
a，与Mn4CaO5团簇相关的单个原子确定。团簇结构与锰/钙原子5σ轮廓的2Fo- -Fc图（蓝色）以及氧原子/水分子7σ轮廓的缩略图（绿色）重叠。b，金属原子与氧oxo或水分子之间的距离（单位为Å）。c，每对锰原子之间的距离。d，锰和钙原子之间的距离。e，Mn4CaO5簇及其配体环境的立体图。所示距离是两种单体之间的平均距离。锰，紫色；钙，黄色；氧气，红色； D1，绿色； CP43，粉红色。
Yasufumi
Umena的研究结果将放氧复合体中四个锰原子和单个钙原子的电子密度被确定并清晰地分辨出来，钙原子的电子密度低于锰原子的电子密度，这使我们能够清楚地识别单个原子。另外，发现了五个氧原子作为oxo桥，连接了缩略图中的五个金属原子。在这五种金属和五个氧原子中，三个锰，一个钙和四个氧原子形成了类似立方烷的结构，其中钙和锰原子占据了四个角，而氧原子则占据了另外四个角。类立方烷结构中氧和钙之间的键长通常在2.4-2.5Å范围内，而氧气和锰之间的键长在1.8-2.1Å范围内。但是，在立方烷一角的一个氧（O5）与钙之间的键长为2.7Å，而O5与锰之间的键长为2.4-2.6Å。由于键长的这些差异，Mn3CaO4类立方烷不是理想的对称结构。
第四锰（Mn4）位于类立方烷结构之外，并通过O5与类立方烷结构内的两个锰（Mn1和Mn3）相连，通过第五氧（O4）以双-μ-oxo桥与Mn3连接。Mn4CaO5团簇的整体结构类似于变形的椅子，不对称的类立方烷作为椅子底座，孤立的Mn4和O4作为椅子的靠背。
Mn4CaO5团簇的最重要的结构特征就是扭曲的椅子形式，这对于阐明水分解反应的机理可能很重要。该研究的很多结果显示，大的变形主要是由Mn4CaO5簇中钙和O5的存在引起的。O5和金属原子之间的距离明显更长，表明相应的键很弱，因此O5的负电荷可能比oxo桥中正常氧原子的价低。这反过来表明，O5可能以氢氧根离子的形式出现在S1状态，并可能为形成双氧提供底物之一。因为W2和W3都在与O5氢键结合距离之内，所以这两种水之一可能会提供另一种底物。
由于在Kok循环中S0和S1之间的跃迁最快，因此在此跃迁期间释放的质子可能会被D1-Tyr
161（又称YZ）接受，并通过质子耦合电子转移使其质子化。W3比O5更接近YZ，可能比O5更适合作为质子释放基团。因此，在S1状态下，W3而不是O5，可能是氢氧离子，这表明W2和W3之间可能会形成O=O键。无论如何，我们的结果表明O=O键的形成发生在O5，W2和W3三种中的两个间。
YZ附近的氢键网络
a，YZ附近的氢键（D1-Tyr 161）。金属原子和水配体之间的键以实线表示，氢键以虚线表示。距离以Å表示。b，从Mn4CaO5团簇通过YZ到管腔体相的氢键网络。参与氢键网络的水分子以橙色表示，而未参与氢键网络的水分子以灰色表示。左上角的绿色区域代表腔体表面。PsbV，浅黄色；其他颜色代码与前面的相同。OEC，放氧复合物。
两个Cl-结合位点的结构
a, 两个Cl-离子的位置。蓝色网孔，在0.9Å的波长下测得的轮廓为4σ的2Fo-Fc图；橙色网格，在1.75Å波长下测量的轮廓为8σ的异常差分傅立叶图。左上角的小密度来自D1-Met 328的硫原子。距离以Å表示。b，从Mn4CaO5团簇通过Cl-1结合位点到腔体的氢键网络。 c，从Mn4CaO5团簇通过Cl-2结合位点到腔体的氢键网络。颜色代码与前面相同。
放氧复合物（OEC）是一种天然酶，可在自然条件下光合作用中催化水的氧化，产生地球上绝大多数生物生存所必需的氧气。正因如此，科研人员对自然界这一最伟大反应的探索从未停止。
2015年1月，Nature杂志在线发表了来自日本冈山大学（第一单位）沈建仁课题组与合作者题为“Native
structure of photosystem II at1.95 Å resolution viewed by femtosecond
X-ray
pulses”的研究论文，该研究使用自由电子激光（SACLA）技术解析了嗜热蓝藻的PSII的S1状态的“无辐射破坏”结构，其分辨率为1.95Å。通过对OCE高分辨率的解析，研究人员认为在S1状态，O5是氢氧离子而不是氧阴离子（去质子化的氧）。O5的不寻常特性以及在S1状态下是OH-离子的指向表明，它在S0状态下是水分子。从S0过渡到S1时，质子从O5位置释放，导致S1状态的OH-产生。O5为形成O
= O键提供了底物水分子之一，这与17O电子-电子双共振检测NMR实验一致。O5的参与，水氧化反应中O =
O键的形成可以在O5与附近的另一个氧原子之间进行，这可能是一个新插入的水分子。基于上述结果，研究人员指出行程O=O的第二个氧原子可能由已经存在的末端水配体W2或W3其中之一提供，因为两者W2和W3在与O5氢键结合的距离之内，因此可能能够在S态过渡期间移向O5以形成O=O键。该成果为氧气释放的机理提供了结构基础，同时将为水氧化人工催化剂的设计提供蓝图。
2015年沈建仁在文章中提出的可能的放氧反应机理
S1状态的O5同时连接到Mn1D（III）和Mn4A（III）。从S1过渡到S2时，电子可能会从Mn4A中脱离，从而导致右侧开放结构（“ R型”），或者从Mn1D中脱离，从而导致左侧开放结构（“ L型”）。两种结构都允许在随后的S状态过渡过程中插入新的水分子，为即将形成O = O键（由底部右侧结构中的红色键表示）之前的过渡状态做准备。或者，可以通过将W2或W3移向O5来准备好形成O = O键的过渡状态（由底部左侧结构中的橙色箭头指示）。灰色：锰；蓝色：钙；红色：oxo氧；黄色：O5；橙色：水。
2017年沈建仁在文章中提出的可能的放氧反应机理
OEC中O = O键形成和质子转移途径的可能机制。虚线圆圈表示与O4键合的水（W567）H附近的水分子（W665）的位移，这导致W567接近O4。虚线箭头表示质子转移的可能途径。用红色虚线包围的两对氧原子代表O = O键形成的可能位点，而O5和O6之间的氧原子距离更短，因此代表了O = O键形成的实际位点。
2017年3月，Nature杂志在线发表了来自日本冈山大学（第一单位）沈建仁课题组与合作者题为“Light-induced structural changes andthe site of O=O bond formation in PSII caught by XFEL”的研究论文，该研究使用使用X射线自由电子激光（XFEL）技术捕捉到了光激发和黑暗状态下PSII复合物的结构，发现了Mn4CaO5簇在水光解过程中的结构变化，更加细致的分析了放氧复合体的结构。结果显示，在OEC周围的区域中，距离Mn4CaO5簇3.5Å的水分子在两次闪光照明下从图中消失了。这缩短了另一个水分子与氧原子O4之间的距离，说明质子转移也发生了。重要的是，两次闪光减去暗处同构差异傅立叶图显示了O5附近的明显正峰，而位于Mn1和Mn4准中心的是独特的μ4-oxo桥。这表明在O5附近插入了一个新的氧原子（O6），这两个氧原子之间的O = O距离为1.5。这为O = O键的形成机制提供更为细致的解释。从分子水平上揭示出氧气形成的可能机理。
2019年10月18日，Science杂志刊登日本冈山大学沈建仁团队最新研究成果，在标题为An
oxyl/oxo mechanism foroxygen-oxygen coupling in PSII revealed by an
x-ray free-electron laser的文章中，研究人员将SACLA
X射线自由电子激光（XFEL）设备产生的量子束照射到光系统II晶体上，分析了S1，S2和S3状态的PSII结构。在S2中未发现水的插入，但是在S2过渡到S3时D1
Glu189的翻转会导致水通道的打开，并提供了一个用于插入其他氧配体的空间，从而导致开放的Mn4CaO6簇与oxyl/oxo桥。PSII在不同S状态之间的结构变化揭示了光合水氧化过程中底物水通道，质子释放和双氧形成的协同作用。
PSII中的供水网络
OEC周围有五个氢键结合的水网络。所示氢键的上限距离为3.3。 CL1和CL2代表在OEC附近发现的氯离子。
OEC的示意图结构以及S1-S3状态中O1和O4通道的状态
可将来自O1通道的水分子掺入S3中的O6中，或重新填充水分子以等待下一个催化反应。
综上所述，光合作用光系统II（PSII）放氧复合体的结构解析经历了由最初的推测有中间体存在，到放氧过程放氧复合物存在S0-S4五种状态，再Mn3CaO4团簇中的原子定位，直到目前水氧化位点，O=O形成位点的确定。PSII氧化水生成氧气过程清晰和系统的研究为PSII供体侧反应，质子产生，氧气释放的机理有了更新的认识，为合成氧化水的人工催化剂提供了扎实的理论基础，意义深远。
由于相关研究内容非常专业，难免有些理解不准确或者编辑整理的疏漏，请以英文原文为准。
参考文献
1. Kok, B., et al. (1970)."Cooperation of charges in photosynthetic O2 evolution–I. A linear fourstep mechanism." Photochemistry Photobiology 11(6): 457-475.
2. Iuzzolino, L., et al.(1998). "X-ray
absorption spectroscopy on layered photosystem II membraneparticles
suggests manganese-centered oxidation of the oxygen-evolving complexfor
the S0-S1, S1-S2, and S2-S3 transitions of the water oxidation cycle."Biochemistry (Moscow) 37(49): 17112-17119.
3. Schiller, H., et al.(1998). "Structure
and orientation of the oxygen-evolving manganesecomplex of green algae
and higher plants investigated by X-ray absorptionlinear dichroism
spectroscopy on oriented photosystem II membraneparticles." Biochemistry (Moscow) 37(20): 7340-7350.
4. Zhang, C., et al. (1999)."New structure model of oxygen-evolving center and mechanism for oxygenevolution in photosynthesis." Chinese Science Bulletin 44(24): 2209-2215.
5. Ferreira, K. N., et al.(2004). "Architecture of the photosynthetic oxygen-evolving center."Science 303(5665): 1831-1838.
6. Sauer, K., et al. (2005)."X-ray spectroscopy of the Mn 4 Ca cluster in the water-oxidation complexof Photosystem II." Photosynthesis Research 85(1): 73-86.
7. Umena, Y., et al. (2011)."Crystal structure of oxygen-evolving photosystem II at a resolution of1.9 Å." Nature 473(7345): 55.
8. Suga, M., et al. (2015)."Native structure of photosystem II at 1.95 Å resolution viewed byfemtosecond X-ray pulses." Nature 517(7532): 99.
9. Suga, M., et al. (2017)."Light-induced structural changes and the site of O= O bond formation inPSII caught by XFEL." Nature 543(7643): 131.
10. Suga, M., et al. (2019). "An oxyl/oxo mechanism foroxygen-oxygen coupling in PSII revealed by an x-ray free-electron laser."Science 366(6463): 334-338.
