荧光定量PCR——qPCR的原理及应用
qPCR的英文全名是Real-timeQuantitative PCR Detecting System。即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称qPCR。
上世纪八十年代Cetus Corporation公司的化学家Kary Mullis发明了PCR，如今DNA扩增技术俨然已经成为了生物学研究的基础。三十多年以来，人们为了解决研究中出现的新问题新需求，不断对这一经典技术进行改良。从经典PCR、实时定量PCR再到现在的数字PCR，PCR技术在不断蜕变却从未淡出我们的视野。如今PCR技术早已走出实验室，在遗传学鉴定和疾病诊断中发挥着巨大的作用，在越来越广阔的领域里焕发着新的活力。
终点PCR是最原始、最简单的PCR方法，如今仍在被我们广泛使用。使用者只能在PCR反应结束之后，通过凝胶电泳、毛细管电泳等方法对产物进行检测。终点PCR本身是无法定量的，因为该反应产出的DNA量不一定能反映最初情况。举例来说，不同样品和序列的扩增效率是有差异的。
PCR的反应过程：
传统PCR电泳结果：
（图片来源于网络）
因此，研究者们克服了PCR定量分析的挑战——实时定量PCR（qPCR）。qPCR主要是利用插入性染料或荧光探针（比如TaqMan），人们可以通过监控PCR过程中的荧光强度比较多个样品的DNA水平。
在qPCR中使用插入性DNA染料，随着PCR循环的连续进行，这种染料的荧光强度会不断增强，从而可以使人们对反应中的DNA进行定量。利用荧光信号的变化，实时监测PCR扩增反应中的每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
qPCR的特点
·灵敏度高
·特异性强
·全封闭PCR过程，无需后续处理
·及时反馈扩增过程，摒弃重点数据，更适用于定量
·定量范围宽，可达10个数量级，无需稀释样品
·可实现一管多检
·仪器自动分析，更快获得结果
qPCR的原理
·什么是Ct值？
PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。
·Ct值的重现性
Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性。
简单来说，模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环次数越少，即Ct值越小；Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知拷贝数的标准品可做出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。
qPCR定量分析，有绝对定量和相对定量两种。
·绝对定量：精确计算初始反应的模板浓度（DNA/RNA）
——病毒DNA或RNA的拷贝数
——转基因的拷贝数
·相对定量：计算初始反应模板的相对含量
——差异表达分析
——芯片评估
——转基因生物的检测
——基因型检测
qPCR常用的荧光标记
·非特异性荧光标记
——SYBR Green I
——EvaGreen
——LC Green
·特异性荧光标记
——TaqMan
——Molecular Beacon
——Amplisensor
qPCR的应用
·基因扩增
·扩增特异性分析
·基因定量分析
·基因检测
·基因分型
·SNP分析
·RFLP多态性分析
·单/多基因表达研究
·高通量基因表达谱研究
目前qPCR技术广泛应用于生物医药食品等行业，运用于疾病的早期诊断、遗传病的早期诊断、药物研究、肿瘤的诊断与研究、食品病原微生物的检测、转基因食品检测、动物疫病检测等。
