Orbitrap Exploris 480：丰富的定量流程介绍（二）
平行反应监控（Parallel Reaction
Monitoring, PRM）是Orbitrap系列仪器上的高分辨靶向定量方法，类似于三重四极杆质谱上的选择反应监控（Selected
Reaction Monitoring, SRM）,其是进行潜在标志物验证的金标准方法之一。
但是PRM一直受到通量问题的困扰，即使采用动态保留时间，也难以在一针采集中同时监控上百条肽段。因此，在2015年Gallien等人在MCP上发表了Internal-Standard triggered PRM（IS-PRM）的方法，其核心思想为对内标肽段进行一个低分辨，低离子注入时间的PRM扫描（内标的含量通常比较高，因此不会受到灵敏度影响），随后在线对该PRM扫描进行实时谱图检索，若能够匹配到目标序列则触发对应內源肽段的高分辨，高离子注入时间的PRM扫描用于定量⁽⁴⁾。该方法由于需要使用赛默飞提供的API对仪器控制软件进行编程修改，因此一直未能得到广泛应用。
而Orbitrap Exploris™ 480上则提供了商品化的，即时可用的SureQuant定量方法，其核心思想和IS-PRM类似，但是其实现更为巧妙和便捷。SureQuant定量流程巧妙的采用了数据依赖的采集方法来实现IS-PRM相同的功能（图3）。
来看我的新方法
首先我们会进行一个一级的全扫，然后采用inclusion list triggered MS² 来对同位素标记的内标肽段进行二级质谱的扫描（inclusion list中包含了所有需要检测的内标肽段），由于内标肽段通常都以较高的浓度掺入，因此针对内标肽段的二级质谱我们会采用低分辨率和低离子注入时间来进行, 从而尽可能的节省扫描时间。随后我们将采集的内标肽段的二级质谱进行快速的在线谱图匹配，如果能否匹配到目标内标肽段序列则触发一个针对內源肽段的二级质谱扫描（通过精确的mass shift来实现），而內源肽段的浓度通常较低，因此我们采用一个高分辨率，高离子注入时间的二级扫描来尽量提升检测的灵敏度。在SureQuant流程中，我们进行DDA的二级扫描时不设置动态排除，因此內源和内标肽段都可以得到完整的PRM的采集谱图。
图3. SureQuant定量流程示意
举个例子
我们以未进行高丰度蛋白去除的血浆蛋白定量作为一个例子。PQ 500 kit中包含了500个血浆蛋白的重同位素标记内标肽段，总计804条重标肽段，可用于对血浆蛋白进行高通量的靶向定量。采用SureQuant定量流程，我们可以通过70分钟梯度的质谱分析实现每针超过550个內源肽段的定量，并且三针之间的检出重复性非常之高（图4）。定量的动态范围从柱上15 pmol到4amol, 跨度大于6个数量级，并且重复进样体现出了相当高的定量重现性（图5）。
图4. 采用SureQuant定量流程对未进行高丰度蛋白去除的血浆样品进行定量分析
图5. 血浆蛋白定量的动态范围和重现性
蛋白质组学新高度
经过三期的介绍，我们发现Orbitrap Exploris™ 480质谱仪作为全新一代Q Exactive系列旗舰机型，是一款以高性能，稳定性和耐久性为最主要考量因素的高分辨质谱仪。，其可以满足绝大多数蛋白组学，转化医学和生物制药的分析需求，并且显著提升实验室数据的产出质量和通量。势必将蛋白质组学，尤其是临床蛋白质组学研究推向新的高度。
参考文献：
1.Bruderer, R., et al., Extending the limits of quantitative proteome profiling with data-independent acquisition and application to acetaminophen-treated three-dimensional liver microtissues. Mol Cell Proteomics, 2015. 14(5): p. 1400-10.
2.Peterson, A.C., et al., Parallel reaction monitoring for high resolution and high mass accuracy quantitative, targeted proteomics. Mol Cell Proteomics, 2012. 11(11): p. 1475-88.
3.Meier, F., et al., BoxCar acquisition method enables single-shot proteomics at a depth of 10,000 proteins in 100 minutes. Nat Methods, 2018. 15(6): p. 440-448.
4.Gallien, S., S.Y. Kim, and B. Domon, Large-Scale Targeted Proteomics Using Internal Standard Triggered-Parallel Reaction Monitoring (IS-PRM). Mol Cell Proteomics, 2015. 14(6): p. 1630-44.
