CRISPR触发的内源Oct4或Sox2基因位点染色质重塑激...（二）

3. CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系统单独对Sox2基因进行内源激活，也能有效获得iPS

研究者单独选取了能对Sox2进行激活的SgRNA进行iPS诱导，发现在有效激活内源Sox2基因表达的情况下，能成功得到诱导性多能干细胞，并能稳定增殖传代。得到iPS通过体内体外实验，如干细胞基因表达情况检测实验（免疫荧光、qPCR等）、囊胚注射实验等，在囊胚注射实验后，还得到了嵌合体小鼠，并能稳定地生殖传递，后代中得到OG2小鼠品系的小鼠。这些实验证明了iPS细胞系的完整干性：稳定自我更新能力和多向分化能力（图4）。
                

图4. CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系统单独激活Sox2内源表达时，能成功实现iPS诱导   

4. CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系统同时对Oct4基因启动子区和增强子区进行内源激活，能有效获得iPS

接下来，研究者选取靶标位置为Oct4启动子区或者增强子区的sgRNA进行诱导实验，发现单独利用Oct4启动子区的sgRNA或者增强子区sgRNA对Oct4基因进行激活时，虽然表达激活，但内源强度无法得与胚胎干细胞系R1相比。在诱导过程中，单独的sgRNA无法得到iPS。Oct4启动子区的sgRNA或者增强子区sgRNA进行组合时，内源Oct4表达强度得到了很好的提升，最终得到iPS，并能稳定增殖传代。得到iPS通过体内体外实验，如干细胞基因表达情况检测实验（免疫荧光、qPCR等）、囊胚注射实验等，在囊胚注射实验后，还得到了嵌合体小鼠，并能稳定地生殖传递，后代中得到OG2小鼠品系的小鼠。这些实验证明了iPS细胞系的完整干性：稳定自我更新能力和多向分化能力（图5）。

            
图 5. CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系统同时对Oct4基因启动子区和增强子区进行内源激活能有效获得iPS                                       

文章小结

作为利用CRISPR-dCas9激活系统进行iPS构建，作者非常有力地证明了CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系统对构建iPS的有效性。可以预见，后续的MEF直接诱导形成心肌细胞、神经细胞的研究中，此系统很可能也有一席之地。此文章既进行了相关技术方法探索，也回答了一个非常好的科学问题：iPS诱导过程中，相关内源基因的表观遗传学变化直观重要。

在表观遗传学研究中，CRIPSR-dCas9激活内源基因表达的应用，会相对广泛一些。CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系统稍加改进，很可能是直接改变相关基因表观遗传学特征的利器。

解析文献
P. Liu, M. Chen, Y. Liu, L.S. Qi, S. Ding. CRISPR-Based Chromatin Remodeling of the Endogenous Oct4 or Sox2 Locus Enables Reprogramming to Pluripotency, Cell stem cell, 22 (2018) 252-261.

参考文献
1. Black, J. B., Adler, A. F., et al. (2016) Targeted Epigenetic Remodeling of Endogenous Loci by CRISPR/Cas9-Based Transcriptional Activators Directly Converts Fibroblasts to Neuronal Cells. Cell stem cell 19, 406-414
2Chakraborty, S., Ji, H., Kabadi, A. M., et al. (2014) A CRISPR/Cas9-based system for reprogramming cell lineage specification. Stem cell reports 3, 940-947
3. Chavez, A., Scheiman, J., et al. (2015) Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature methods 12, 326-328
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5. Buganim, Y., Faddah, D. A., et al. (2012) Single-cell expression analyses during cellular reprogramming reveal an early stochastic and a late hierarchic phase. Cell 150, 1209-1222
6.Takahashi, K., and Yamanaka, S. (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676