Morris水迷宫实验、避暗实验对子代小鼠学习记忆能力的影响机制

Ø 【摘 要】                                                                 

目的 探讨富含α- 亚麻酸(α- LNA) 的胡麻籽油( 亚麻油) 对子代小鼠脑发育及功能的影响。方法取性成熟小鼠45只,雌雄为2 ∶1 , 将怀孕雌鼠随机分为4 组, 分别给予胡麻籽油2 g (A组) 、5 g (B组) 、10 g (C组) /kg 体重和对照组(0组) , 连续给孕鼠经口灌胃至仔鼠断乳,母鼠处死, 将仔鼠雌雄分笼, 雄鼠立即处死进行脑体重量测定并计算脑体比; 再将雌鼠C组分为C 组和D 组, A、B、C 组雌鼠继续按母鼠剂量补充胡麻籽油, 每天1次, D 组不补充胡麻油继续喂养; 5 周后进行小鼠避暗和水迷宫实验, 测定后取脑进行蛋白质(TPRO) 、乙酰胆碱脂酶( AChE )及一氧化氮(NO) 指标测定。结果 ①子鼠体重随剂量的增加而下降, C组下降明显, 与对照组比较差异有统计学意义( P<0.05) , 脑体比各组之间差异无统计学意义(P>0.05) 。②水迷宫实验结果显示: B 组、D 组与对照组比较游泳时间缩短, 错误次数减少( P<0.05 ) ; 小鼠避暗实验结果显示各剂量组的潜伏期较对照组延长, 而错误次数减少, 但差异无统计学意义。③TPRO 随剂量的增加而增高, D 组较0 组和A 组明显增高, 差异有统计学意义（P<0.05) ; Ac hE 各组之间差异无统计学意义; NO 含量A 组较C 组有明显增高(P<0.05) , 较B、D 组差异有统计学意义( P<0.01 ) 。结论 在小鼠胚胎期及婴幼期补充胡麻籽油可提高脑内蛋白质含量, 促进小鼠学习记忆能力, 可引起脑内NO 含量的变化。

Ø 【关键词】                                                                 

水迷宫； 避暗实验；学习记忆; 神经递质; 亚麻籽油

胡麻籽油又称亚麻籽油, 是我国西北和晋西北等地区主要的食用油, 资料显示, 胡麻籽油中α- 亚麻酸(α- LNA) 含量达61.27%[ 1] 是植物油中含量最高的。α- LNA 为n - 3 系多不饱和脂肪酸,是人体必需脂肪酸, 在体内可有效地转变为二十碳五烯酸(EPA) 和二十二碳六烯酸(DHA) , 而发挥其生理功能。多年来关于n - 3 系多不饱和脂肪酸, 尤其是DHA( 鱼油的主要成分) 在促进大脑发育及视网膜功能方面的作用被研究证实; 此外与胡麻籽油结构及α- LNA 含量相近( 50%以上) 的紫苏籽油被实验证明有促进小鼠学习记忆的作用。本实验以胡麻籽油作为α- LNA 的来源, 对摄入胡麻籽油的小鼠进行了学习记忆及脑内部分神经递质的测试, 以观察胡麻籽油对胚胎及生长发育期小鼠脑发育的影响,为更好开发胡麻籽油提供依据。

Ø 材料与方法                                                                  

1.1 样品来源

胡麻籽油: 产自山西省五寨县, 胡麻籽经超临界CO2 提取,α- LNA 含量为50.50% 。

1.2 实验动物与基础饲料

选性成熟昆明种小鼠45 只, 雌性30 只, 雄性15 只; 实验动物和饲料均购自山西医科大学实验动物中心。

1.3 仪器

小鼠水迷宫仪、XR-XC105 型小鼠被动回避条件反射仪;1.4 试剂一氧化氮( NO) 、乙酰胆碱酯酶( AChE ) 和蛋白质( TPRO) 试剂盒均购自南京建成生物工程研究所,其余试剂均为市售分析纯。Morris水迷宫系统可由上海欣软信息科技有限公司提供。

1.5 实验方法

1.5.1 剂量分组与喂养: 选性成熟小鼠雌性30 只,雄性15 只, 以2 ∶1 进行合笼, 次晨以查到精子为受孕0 d , 自妊娠0 d 起雌鼠分笼饲养, 将孕鼠随机分为4 组, 即A、B、C 3 个剂量组和一个对照组( 0 组) ,在受孕第0 天起分别给予A、B、C 为2 、5 、10 g/kg 体重的胡麻籽油, 连续灌胃至子鼠断乳, 新生鼠出生后调整每窝仔鼠数6～9 只, 将断乳仔鼠雌雄分开, 雄鼠立即处死进行脑体重量测定并计算脑体比; 将雌鼠C 组分为数量相同两组即C 和D 组, 除D 组不给胡麻籽油外, 其余继续按母鼠剂量补充胡麻籽油, 每天1 次, 连续5 周。

1.5.2 脑重测定: 分别取断乳和56 d 龄子鼠称重,断头后取脑组织称重, 计算脑体比。

1.5.3 小鼠水迷宫实验: 将补充胡麻籽油5 周后仔鼠每组随机选10 只开始训练, 训练期间继续给受试物, 每天1 次。迷宫泳道水深15 cm, 水温( 25±1 ) ℃。实验时, 将小鼠放于泳道的起点处, 开始计时, 观察其到达终点所需时间, 以及出现错误次数。将小鼠训练时间限定为120 s , 在120 s 内未到达终点的小鼠均记为120 s 。共训练5 d , 末次从起点进行训练。最后计算各组动物的错误次数, 到达终点的时间及到达终点的动物数。

1.5.4 小鼠避暗实验: 将补充胡麻籽油5 周后仔鼠每组随机选10 只, 进行避暗实验, 记录每鼠从放入明室到进入暗室遭电击所需的时间, 此即潜伏期, 训练5 min , 并记录5 min 内电击次数, 24 h 后重做测验, 记录每只动物进入暗室的潜伏期和5 min 内的电击次数, 以此作为记忆的成绩。

1.5.5 TPRO、NO、AChE 的测定: 测试完水迷宫实验的小鼠处死, 取脑在4 ℃下匀浆, 进行TPRO、AChE和NO 测定, 方法由南京建成生物工程研究所提供。

1.6 统计学分析

用统计软件SPSS 10.0 进行统计分析, 采用单因素方差分析、泊松分布及非参数统计方法。

Ø 结 果                                                                        

2.1 脑体比: 表1 结果显示断乳期小鼠体重、脑体比各组间比较差异无统计学意义( P >0.05 ) ,而56 d 龄小鼠随剂量的增加体重明显下降, C 组与各剂量组比较差异有统计学意义( P <0.05 ) , 脑体比C 组也相对增加, 较对照组差异有统计学意义( P<0.05 ) 。

2.2 小鼠学习记忆实验: 见表2 。从表2 结果显示小鼠游出迷宫游出时间B 组与D 组缩短, 错误次数减少, 与对照组比较差异有统计学意义( P<0.05 ) 。小鼠避暗潜伏期剂量组有延长趋势, 错误次数减少, 但与对照组比较差异无统计学意义( P>0.05 ) 。

2.3 小鼠脑组织TPRO、NO、AChE 测定结果TPRO 含量有明显的剂量反应关系, D 组较0 组和A 组明显增高, 差异有统计学意义, D:0 为P <0.01 , D:A 为P <0.05 ; NO 测定中, B、C、D 组较对照组明显降低, A 组增高明显, 与C 组比较差异有统计学意义( P<0.05 ) , A 组与B、D 组比较差异有统计学意义( P <0.01 ) , A 组与0 组比较差异无统计学意义; AChE 虽比B、C 组明显增高, 但各组比较差异无统计学意义。

Ø 讨 论                                                                        

本实验在孕乳期至子鼠56 d 龄期间分别给孕母鼠及子鼠补充胡麻籽油作为α- LNA 的来源, 经行为学测试结果表明胡麻籽油有促进小鼠学习与记忆的作用, 与紫苏油促进小鼠学习记忆能力的研究报道相符, 但其作用与摄入量不成正比, C 组作用减弱, 这可能与过量的不饱和脂肪酸摄入产生脂质过氧化有关, 有待进一步研究。而且D 组学习记忆能力的明显增强也表明即使在断乳后终止补充α- LNA, 子鼠从母体获取n- 3 系列多不饱和脂肪酸仍能发挥其生物效应。在胚胎及婴儿脑神经系统发育的关键时刻需要补充更多n - 3 系列多不饱和脂肪酸, 而此阶段动物脑和肝脏合成DHA 的酶系统不健全, 去饱和酶活力水平较低, 在婴儿体内利用α- LNA 合成DHA 的能力很低, 其主要从母体和乳汁中获得。另据报道DHA 在妊娠期和婴儿期快速积累于婴儿组织中, 其来源于母体的贮备, 即孕期由膳食直接供给或由膳食中α- LNA 在体内的合成, 通过胎盘选择转运完成。因而给孕鼠补充α- LNA 对促进子鼠脑发育是有益的。

TPRO、NO 与AchE 与脑功能有密切关系, 学习记忆时蛋白质合成增加并有新的蛋白质或肽产生, 蛋白质水平影响子代脑发育和功能。本实验脑内蛋白质含量随剂量的增加而增高, 表明α- LNA 能影响脑蛋白质的合成从而影响脑发育及功能; NO 是近年来被认识的一种神经递质, 释放适量的NO 可促进学习能力, 并通过实验得出NO 对初生小鼠学习记忆过程及记忆的再现起中心调控作用。本实验对56 d 龄子鼠脑NO 测试显示在不同剂量组较0组有升高也有下降, A 组明显升高, 但与0 组比较差异无统计学意义, A 组与C 组差异有统计学意义( P<0.05 ) , B、D 组比较差异有统计学意义( P<0.01 ) 。表明摄入不同剂量的α- LNA 对脑内NO 影响各异, 是否与其中心调控作用有关及其他原因有待进一步探讨; 乙酰胆碱是脑内的神经递质, 与认知、学习、记忆等大脑高级神经功能有关, 学习、记忆任务的完成伴随着脑内乙酰胆碱的变化。AChE 是乙酰胆碱的分解酶, 它的活力变化可间接反映脑内乙酰胆碱含量。