酶法检测磷酸化实验
实验方法原理
实验材料 含 100～200 μg 总蛋白的样品
试剂、试剂盒 50 mmol L NN'-2-羟丙磺酸哌嗉(PIPES)Sephadex G-25 柱（可选）PIPES 2－ME 或 RPERS DTT 缓冲液马铃薯酸性磷酸酶2 × SDS－PAGE 样品缓冲液100 mmol L 焦磷酸钠
仪器、耗材 90℃ 水浴或加热块
实验步骤
1. 制备含 100～200 μg 总蛋白的样品。通过透析或脱盐除去抑制性的代谢产物，或用 2 或 3 倍体积 50 mmol/L PIPES 缓冲液 pH 6.0，洗涤除去微粒物质。
2. 样品在 100 μl PIPES/2－ME 或 PIPES /DDT 缓冲液，pH 6.0 中 30℃ 温育 10 min。
3. 加入 5～10 U 马铃薯酸性磷酸酶，30℃ 温育 15 min。
4. 取出 10 μl 样品加入等体积 2 × SDS 样品缓冲液。90℃ 加热 5 min。
5. 在 SDS 聚丙烯酰胺凝胶中电泳脱磷酸样品。放射标记的样品通过放射自显影或磷成像分析底物蛋白放射标记物的丢失；非标记样品通过免疫印溃分析底物迁移率的变动。
6. 剩余的样品加入 10 μl 的 100 mmol/L 焦磷酸钠（终浓度 10 mmol/L）以终止脱磷酸反应。通过适当的蛋白质功能分析方法分析底物脱磷酸化的变化。
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