实验方法原理 用胰蛋白酶消化 75 cm2 培养瓶中的细胞，计数后与藻酸盐溶液混合。用注射器将藻酸盐细胞悬液滴加入氯化钙溶液，制成微珠，然后悬浮培养。

实验材料 D-PBSA胰蛋白酶

试剂、试剂盒 适合细胞生长的培养液藻酸钠溶液

仪器、耗材 无菌滤器

实验步骤

盐溶液，含有：

(a)NaCl，8.0 g

(b)D-葡萄糖，l.0 g

(c)用 UPW 配制1 L

(d)用 HCl 或 NaOH 调整 pH 为 7.2~7.4

(e)高压灭菌

0.1 mol/L CaCl2，含有：

(a)盐溶液，500 ml

(b)CaCl2 2H2O，7.35 g

(c)用 HCl 或 NaOH 调整 pH 为 7.2~7.4

(d)高压灭菌

1. 按 1.5 % 浓度将藻酸盐溶解于盐溶液中，在室温下将溶液搅拌至少 4 h，直至藻酸盐完全溶解。溶解于盐溶液的藻酸盐可以在4°C 条件下储存 3 d。

2. 用灭菌的无热源活性的 0.45 μm 滤器将藻酸盐过滤 3 次。最后一次过滤应当在藻酸盐使用前进行。

3. 将细胞培养至汇合状态。

4. 用 3 ml 胰蛋白酶（适合于细胞传代培养的浓度）消化细胞，然后细胞计数。

5. 将细胞离心（900 r/min，4 min ) 后，完全弃去含有胰蛋白酶的上清液。

6. 通过将细胞轻轻地悬浮于藻酸盐中，使细胞与藻酸盐混悬，调整细胞密度为 2×106 个/ml。此刻，在藻酸盐中不产生气泡是至关重要的，因为产生气泡将会导致微珠内形成空隙。

7. 将藻酸盐悬浮的细胞转移入套有 27G 针的无菌注射器中。

8. 利用迂冋运动将藻酸盐细胞悬液滴加入含有 0.1 mol/L CaCl2 的烧杯中，CaCl2 诱发藻酸盐微珠的形成。

9. 使微珠胶化 10 min，然后用 D-PBSA 洗 3 次。

10. 最后用生长培养液洗微珠。

11. 将微珠放入含有生长培养液的 175 cm2 培养瓶中，在 37°C、100 % 相对湿度和 5% CO2 条件下培养。