HRM介绍

　　 HRM技术是 high-resolution melting analysis即高分辨熔解曲线分析技术，是近年国外兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。基于高效稳健的 PCR技术，HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在 PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性 -SNP、甲基化、 HLA配型等的分析。

　　 因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作， HRM技术受到普遍关注。

　　HRM原理

　　 HRM的主要原理是根据 DNA序列的长度， GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。随着高精度 PCR仪（ LightCycler® 480和 Rotor-Gene 6000）和饱和染料（ LC Green、 Eva Green等）的出现，HRM技术的普及使用成为可能。

　　HRM应用

　　SNP（单核苷酸多态性）的筛查。

　　 基因突变扫描，包括缺失、重复、点突变。

　　 新突变的筛查。

　　 甲基化的筛查。

　　 遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。

　　 HLA基因组配型、等位基因频率分析、物种鉴定、品种鉴定、甲基化研究。

　　 法医学鉴定、亲子鉴定。

　　 动植物品质相关多态性位点的研究等。植物抗逆性，突变与性状关联性研究。

　　HRM特点

　　 高通量：1次可同时检测 10-384样本，适合大样本、多 SNP、多突变位点及多位点甲基化的扫描。

　　 高敏度：肿瘤研究中低突变率样品基因突变检测，最低检测到 0.1%的突变样品基因突变，即检测到 1000个正常细胞中 1个突变细胞，适用于手术和其它微量组织中突变检测。检测灵敏性远高于“ PCR+测序”的 25%，即 100个正常细胞中至少有 25个突变细胞，测序仅适用手术组织。

　　 特异性好：PCR产物无需后续处理，特异性高达 100%。直接未知杂合突变鉴定准确性 100%，特异性 100%。直接未知纯合突变鉴定准确性 96%，利用非标记探针快速基因分型法直接未知纯合子鉴定准确性 100%。

　　 重复性好：重复性 100%

　　 使用范围广：不受碱基位点局限，除可检出已知突变外，也能检测出未知突变。

　　 重复性好：样品 PCR和 HRM分析直接在同一管内进行，实现闭管操作，避免交叉污染。

　　 操作简便：只需设计特异引物，无需序列特异性探针，无需测序，也不受突变碱基位点与类型的局限。

　　 成本低：简化操作时间和步骤，大大降低成本，检测费用远少于测序、 Taqman探针技术。

　　 标本范围广：可用于新鲜或酒精固定、石蜡包埋的手术标本，也可用于微量的穿刺或活检标本、血液标本、粪便标本等非手术标本的检测。传统 PCR+测序”方法难以检测大部分不能手术的患者。

　　 其它：只检测 PCR样品中荧光强度的变化，不消耗任何 PCR样品，无污染， PCR产物可以进行下游分析，非常适合于测序前的 SNP、甲基化等预扫描筛查。

　　HRM应用举例

　　SNP检测

　　 单核苷酸多态性（ Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs），指单个核苷酸碱基的改变，包括置换、颠换、缺失和插入，导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，这就是 SNP。SNP在人类基因组中数量较多，发生频率较高，因此被认为是继微卫星之后的新一代遗传学标记。

　　 HRM检测 SNP技术是依据在一定的温度范围内将 PCR扩增的产物进行变性，期间实时检测体系内荧光信号。荧光值随着温度变化，可绘制溶解曲线。每一段 DNA都有其独特的序列，因而也就有了独特的熔解曲线形状，如同 DNA指纹图谱一样，具有很高的特异性、稳定性和重复性。根据曲线准确区分野生型纯合子、杂合子和突变性纯合子（下图）。

　　 检测 SNP的方法有很多种。成本较低、通量较大的方法大都局限于已知、特定位点，如 Taqman探针法。既要对已知位点分析又要查找未知位点，一般采用 PCR+测序的方法，成本高、操作繁复较低。

　　 HRM技术是一种低成本、高通量、快速，且不受位点局限的检测方法，是 SNP筛查的最佳选择。

　　甲基化检测

　　 DNA甲基化是 D NA碱基序列 C pG岛上常发生的一种共价修饰，使基因表达受抑制，可以遗传。在肿瘤等病理组织中，特异基因的特征性甲基化状态可以作为早期诊断的重要标志物。甲基化检测包括特异性 P CR、Northern印迹法、芯片等，测序是金标准，但这些方法低通量、成本高、花费大量时间且难以标准化。

　　 高分辨率熔解（H igh ResolutionMelt,HRM）是一种最新的在表观遗传学中检测 C pG位点的一种新技术，可区别单个碱基的甲基化差异（下图）。

　　 HRM检测甲基化的方法具有高通量、操作简单、灵敏高、重复性高、成本低、不受检测位点的局限高度等优势，将对于遗传学、肿瘤学等方面的研究和临床应用提供更大的帮助。

　　突变筛查

　　 HRM的特点是高特异性和高灵敏度，检测灵敏度可以达到 1%-0.1%。在大量样本、多个突变位点的筛查上，比传统的非均一性方法（如 dHPLC）更方便、性价比更高，因为后者需要将扩增产物转移到另一台仪器上进行突变分析。

　　 HRM可对任何扩增子上的未知突变进行筛查，不需要识别不同等位形式的引物或探针，不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析。所以，相比定量探针法的突变分析和其它类型的快速突变分析法，应用面大大拓展，成本也大大降低，成为近年来国外新兴的遗传学、方法学研究和应用热点。

　　图：HRM分析 219bp的人类 MBL-2基因片段（384个样本），结果显示了四种主要的基因类型（蓝色、红色、绿色和橄榄绿色）和两个少数样本的基因型（橙色和红紫色）。

　　其它应用

　　植物和动物品质和育种中基因型鉴定：HRM方法快速而有效的解决如何确定亲本的基因型是否相同、有否新型性状的遗传突变等问题。

　　HLA基因组配型：器官移植的 HLA配型、同胞之间 HLA基因型确定，应用举例：快速确定 HLA高度多态性位点的类型，及非亲源关系个体间异源造血干细胞移植前的 HLA基因型确认。

　　等位基因频率分析：SNP频率分析等。

　　物种鉴定、品种鉴定：微生物品种、物种快速鉴定；动植物品种鉴定。应用举例：临床细菌的鉴定。对临床细菌的培养物进行 16SrRNA的实时扩增，并进行 HRM分析，每个菌种的熔解曲线模式就如果该物种的分子指纹，从而可以根据 HRM的不同对细菌进行鉴定。

　　法医学鉴定、亲子鉴定：检测单核苷酸多态性 SNP鉴定，插入 /缺失多态性 DIP鉴定等。应用举例：将 HRM用于法医学 SNP、DIP鉴定，协助犯罪鉴定，亲子鉴定。相对于传统鉴定方法，HRM是一种简单、便宜、高通量的二等位基因分子标记鉴定的方法。

　　样品处理：

　　 组织标本：取新鲜组织块 50mg，一种用液氮或干冰保存、运输，另外可放入装有含 RNAlater冻存管（本公司提供），4℃低温保存并常规冰袋运输。

　　 穿刺或者活检标本：处理方式同上。

　　 酒精固定标本：对于不能送检新鲜标本的送检者，请将标本从手术台上取下后，立即切取肿瘤标本（≥5mm3），放于容器内（如带盖的塑料瓶），采用 75％的乙醇立刻固定，保证酒精的体积是标本的 5倍左右。

　　 石蜡包埋组织切片：要求提供 10张组织切片（面积 >10 mm×10 mm，厚度约 5－10μm），载玻片片盒保存、常温运输。如果组织太小，请酌情增加送检样品数量。

　　 血液样本：取 5ml抗凝血，获得血浆，常规冰袋 4℃低温运输。

　　 胸腹水：肿瘤胸腹水离心后加 75%的酒精 1 ml。

　　 粪便：收集 10g粪便，用柱式离心的方法收集基因组 DNA。

　　参考文献

　　  Oliver Geulen, Christian Weilke, Michael Hoffmann.The LightCycler 480 real-time PCR system: a versatile platform for genetic variation research. Nature Methods 5, (29 February 2008) doi:10.1038/nmeth.f.207.

　　  The LightScanner System: Ultra Fast Mutation Discovery and Gene Scanning Nature Methods Application Notes (2 May 2006) doi:10.1038/an1611.

　　 Erali M, Voelkerding KV, Wittwer CT. 2008. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Exp Mol Pathol 85:50–58.

　　  Wojdacz TK, Dobrovic A, Hansen LL. Methylation-sensitive high-resolution melting. Nature Protoc. 2008；3(12):1903-8.

　　  Fukui T, Ohe Y, Tsuta K, Furuta K, Sakamoto H, Takano T, Nokihara H, Yamamoto N, Sekine I, Kunitoh H, Asamura H, Tsuchida T, Kaneko M, Kusumoto M, Yamamoto S, Yoshida T, Tamura T. Prospective study of the accuracy of EGFR mutational analysis by high-resolution melting analysis in small samples obtained from patients with non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2008 Aug 1；14(15):4751-7.

　　  Smith GD, Chadwick BE, Willmore-Payne C, Bentz JS. Detection of epidermal growth factor receptor gene mutations in cytology specimens from patients with non-small cell lung cancer utilising high-resolution melting amplicon analysis. J Clin Pathol. 2008 Apr；61(4):487-93.

　　  Takano T, Ohe Y, Tsuta K, Fukui T, Sakamoto H, Yoshida T, Tateishi U, Nokihara H, Yamamoto N, Sekine I, Kunitoh H, Matsuno Y, Furuta K, Tamura T. Epidermal growth factor receptor mutation detection using high-resolution melting analysis predicts outcomes in patients with advanced non small cell lung cancer treated with gefitinib. Clin Cancer Res. 2007；13(18 Pt 1):5385-90.

　　 Simi L, Pratesi N, Vignoli M, Sestini R, Cianchi F, Valanzano R, Nobili S, Mini E, Pazzagli M, Orlando C. High-resolution melting analysis for rapid detection of KRAS, BRAF, and PIK3CA gene mutations in colorectal cancer. Am J Clin Pathol. 2008；130(2):247-53.

　　 Chagné D, Gasic K, Crowhurst RN, Han Y, Bassett HC, Bowatte DR, Lawrence TJ, Rikkerink EH, Gardiner SE, Korban SS. Development of a set of SNP markers present in expressed genes of the apple. Genomics. 2008；92(5):353-8.

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